药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析

药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析一、线性试验主成分含量测定以测定浓度为100%，50%~120%之间选取5个点即可。溶出（释放）度测定以释放量的10%～120%间选取5个点即可。杂质含量用杂质对照品准确测定以杂质限度为100%，50%~120%之间选取5个点即可。测定结果：1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。2）误差在哪里，应用时的注意事项。3）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、N结构，紫外监测器决定。个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会出现不成线性。4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的原理知晓。唑来磷酸结构式引申使用：1）有关物质测定归一化法和自身对照法的相互妙用。2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定为中间浓度。举例说明。3）回收率试验为何做80%~120%即可？亦及样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的理解。4）国内只注重相关系数，不注重截距。二、精密度试验重复性试验：连续进样6次。中间精密度试验和重现性试验通过“耐用性试验中的溶液稳定性试验”来体现。浓度极低时才会不理想，加大进样量。色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被测物质峰尽快出峰。三、准确度试验用回收率来衡量作法：在80%~120%间选择3点或5点，原因是由外标一点法决定的。已知杂质、且有杂质对照品的，可采用加入法，即加样回收率来评价。一般情况下，只要空白辅料无干扰，回收率均是良好的！四、专属性有关物质为主，其他检测项目（含量）基本上均参照有关物质。有关物质的验证，采用中间体和降解产物（确认结构后人工合成）来验证与主成分的分离。系统适用性试验的配制方法：在100％浓度的主成分溶液中加入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中有可能存在的状态。介绍配制方法——先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓的对照品溶液）来稀释，简便、易行！专属性试验验证图谱存在问题——配制相同浓度，测定样品时，主成分峰骤然加大，将杂质峰覆盖。强破坏试验的目的：验证药品在遭遇了极端的气候环境条件下产生的杂质，在所建立的色谱条件下是否能够分离、测定。●检测波长的确定涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分）选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f1.0），否则将得到错误的判断。介绍该项检测的由来和历史背景要看主峰里是否有杂质，如何判断？但需注意DAD检测器的局限性，介绍“土办法”！结果：目前从来没有推翻现行色谱条件的。意义在哪里。如何应用，拿到只是“走形式”？最小峰面积的设定●其设定，不是绝对值，而是相对值。●英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品测定时，通常为1/10~1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。●原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。强力破坏试验●水破坏取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。●氧化破坏取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在90℃放置24小时。●强碱破坏取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90℃放置24小时。●强酸破坏取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在90℃放置24小时。●高温破坏取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变●强光破坏取原料适量，置紫外灯下照射48小时。四、检测限●信噪比的三倍——纯属“纸上谈兵”，实际测定中根本用不上。●是相对值，不是绝对值。是相对于供试品溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系积分参数的设定●积分参数的设定是非常重要的。由斜率(Slope)、峰宽(Width)、最小峰面积(MinArea)组成。●采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。●供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大，又将反映不出杂质情况。方法学认证中的耐受性试验是指更换试验因素，如不同人员、不同仪器，不同色谱柱型号、厂家，不同试剂等因素。这一点才是真正至关重要的！认证时不可能做到这一点，出现问题时往往要考虑到。方法学认证中溶液稳定性的全面判定•不能单从主成分入手！•还要注意所有组分的百分比变化，绝对值变化！min024681012141618202224mAU60708090100110120130140150160mAU60708090100110120130140150160917085.9230.86104328888.41098.165918514.6260.564500222.7290.422:210nm,8nm傾乕僥僗僱乕僩昗弨梟塼傾乕僥僗僱乕僩昗弨梟塼02-Rep4柺愊曐帩帪娫柺愊%杂质-1（为已知杂质）青蒿琥酯杂质-2杂质-3新杂质时间(h)峰面积百分比峰面积百分比峰面积百分比峰面积百分比均未检出0148110.14%1036960099.26%575110.55%50320.05%0.5360280.35%1014652598.89%557860.54%223310.22%1595200.57%1038238898.58%580980.55%317170.30%1.5689800.66%1034454198.45%595210.57%338980.32%2789480.75%1036038698.33%591720.56%380650.36%3917080.86%1043288898.16%591850.56%4500020.42%RSD0.96％流速、柱温与溶剂的选择●在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，且使主成分峰不拖尾即可。●柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。●溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。质量标准中制订有关物质的原则●采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。●采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰的分离度应符合规定。●不采用任何方式。典型强破坏试验图谱min0510152025303540mAU0246VWD1A,Wavelength=280nm(XMF\05112203.D)15.753min0510152025303540mAU0246VWD1A,Wavelength=280nm(XMF\05112204.D)14.81215.928min0510152025303540mAU0246VWD1A,Wavelength=280nm(XMF\05112205.D)药品含量测定方法的设计——原料药•原料药:对于组份单一的原料药,首选容量法测定含量强调：（1）供试品的取用量应满足滴定精度的要求（消耗滴定液约20ml）；（2）滴定终点的判断要明确，如选用指示剂法，应考虑其变色敏锐，提供滴定曲线，并用电位法校准其终点颜色。（3）为排除因加入其它试剂或混入杂质对测定结果的影响，或便于剩余滴定法的计算，可采用“将滴定的结果用空白试验校正”的办法；（4）最后要给出滴定度（采用四位有效数字）。•容量法测定含量要注意参加反应的应是药物分子活性部分，而不应是次要的酸根或碱基部分。如盐酸氨溴索，有研究者采用氢氧化钠滴定液测定其含量，事实上这种方法测定的是其中盐酸的含量，由于其成盐工艺中的酸、碱配比不当时，可严重影响成品酸碱度，故测定结果并不能代表其活性成分有机碱的含量。应采用非水滴定法，以无水冰醋酸为溶剂屏蔽掉盐酸的干扰，用高氯酸滴定其有机碱的含量。高氯酸非水滴定法因适应性广（适用于有机弱碱及其盐类）在化学原料药的含量测定中较为常用。•如用容量法不适宜时，可考虑选用HPLC法，尤其在有关物质干扰，或多组份物质时，具有特殊优势。•一般不选用UV法，尤其不首选“吸收系数法”定量，不选用末端吸收峰作测定波长；须用UV法时，可采用不受仪器及其它变化影响的“对照品比较法”定量，测定溶液的吸收度宜在0.3～0.7间。•元素测定法如定氮法，在其它方法均不适宜时可采用，但因不能反映化合物含量的变化情况，此法不可用于稳定性考察中。药品含量测定方法的设计——制剂•应考虑辅料等的干扰，首选方法一般为HPLC法，在有关物质、辅料不干扰的情况下，也可选用UV法或原料药项下的容量法。•复方制剂首选HPLC法。药品含量测定方法的设计——验证•订入质量标准的含量测定法不同于一般质量考察的方法，须经过严格的方法学验证。•容量分析法的验证：①精密度：用原料药精制品（含量99.5%）考察方法精密度，平行试验5个样本的RSD≤0.2%；②准确度：以测定原料精制品的回收率计算，应在99.7%～100.3%之间（n＝5,RSD≤0.1%）；③滴定终点确定的依据：包括滴定曲线的绘制，如用指示剂法确定终点，应用电位法校准终点颜色，提供指示剂颜色与电位变化情况的对比结果；•④耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明。•HPLC法的验证：①精密度：RSD≤2%（n＝5）；②准确度：用于制剂时，要考察辅料的影响，将一定量药物加到按处方比例配制的辅料中（为标示量的80%～120%）制成高、中、低三个剂量，混合均匀后，每个剂量取三份样品，按拟定方法测定回收率，应在98%～102%之间（n＝9,RSD≤2%）。•③线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓度的溶液（n＝5～7），用浓度C对峰面积A或峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，线性方程的相关系数r≥0.9990，截距越小越好，并提供线性关系图；•④专属性：辅料、有关物质或降解产物峰对主药峰应无干扰；•⑤耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、流动相组成和pH值、不同品牌或批号的同类色谱柱、柱温、流速、样品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明；•⑥灵敏度：作为常量分析法，此项可不作主要要求。•UV法的验证：①精密度：RSD≤1%（n＝5）；②准确度：方法同HPLC法，回收率应在98%～102%之间（n＝9,RSD≤2%），同时要求辅料、有关物质或降解产物在测定波长处无吸收。•③线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓度的溶液（n＝5～7，吸收度A在0.3～0.7间），用浓度C对A进行回归处理，线性方程的相关系数r应≥0.9990，截距应趋于零，并提供线性关系图；•④耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样品提取次数、时间、比色法中显色剂用量、反应温度、时间、pH值等）有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明。