第8章 植物转基因技术

第六章小结植物体细胞杂交即原生质体融合，是获得胞质杂种的理想途径体细胞杂交在远缘育种与新物种、新资源创造中具有深远意义原生质体融合技术主要有PEG融合和电融合杂种的成功培养是建立在原生质体的培养技术上的，选择和鉴定是获得细胞杂种的关键提高融合效率和培养重复性是该技术研究的重点细胞杂种是体细胞遗传研究的良好体系思考题1、原生质体定义2、原生质体分离、纯化方法3、原生质体融合方法及原理4、原生质体融合的意义5、植物原生质体培养的方法6、植物体细胞杂交的概念和类型7、体细胞杂种鉴定方法8、体细胞杂种应用植物基因转化技术载体介导法,如农杆菌介导转化法DNA直接转移法植物生物反应器第八章植物转基因技术•转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。•转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。•转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。8.1植物基因转化技术目的基因克隆的基本步骤•①分离获得目的基因；•②在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到能自我复制又带有选择标记的载体上；•③将重组DNA转移入受体细胞；•④筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；(1)载体介导法,如农杆菌介导转化法根瘤存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumorinducingplasmid）。①Ti质粒转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。T-DNA（transferred-DNA）冠瘿碱（opine）的作用冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，进入和整合。冠瘿碱代谢基因分别编码代谢冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。第一步:植物受伤植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。②农杆菌的感染和生存第二步感染植物农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。第三步毒性基因（vir）表达T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。virA、virG、virD、virB第四步T-DNA转移第五步诱导冠瘿瘤T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。第六步土壤农杆菌代谢冠瘿碱。改造后的Ti质粒载体模式ori叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡筛选培养基愈伤组织分化幼苗优点:多为单拷贝或寡拷贝整合，转基因遗传较稳定，减少了共抑制等基因沉默现象．属于单细胞转化，不存在嵌合体现象；成本较低，转化效率较高。植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化(2)DNA直接转移法①电击法转化效率较低，且仅限于能由原生质体再生出植株的植物。②基因枪法（genegun）•基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。又称高速微粒轰击法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m钨弹头吸附特制手枪射击植物装入但进去的DNA片段整合效率极低，不易获得再生植株，可能发生共抑制现象.基因枪法（genegun）8.2植物生物反应器植物生物反应器是指通过基因工程途径，以常见的农作物作为“化学工厂”，通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂的方法。在植物生物反应器研究中，最受人们关注同时研究进展也最快的是生产各种疫苗用的抗原蛋白。疫苗的形式也由菌体疫苗发展到亚单位疫苗（Subunitvaccine），甚至还产生了DNA疫苗。8.2植物生物反应器1992年，美国人C.J.Arntzen和H.S.Mason率先提出了用转基因植物生产疫苗的新思路。此后，国内外多个实验室相继在烟草、马铃薯、番茄、苜蓿和莴苣中表达了乙肝表面抗原、大肠杆菌热敏毒素B亚基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒壳蛋白和狂犬病毒G蛋白等抗原，并利用在植物中表达的抗原进行了动物和人体的免疫实验，获得了大量有价值的研究数据，为今后利用转基因植物生产疫苗奠定了良好基础。植物来源的重组药用蛋白第一次临床应用研究是由星球生物技术有限公司（PlanetBiotechnology,Inc）.美国著名的孟山都公司（Monsanto）已经培育出一种转基因玉米，每公顷玉米可以产生3.7公斤达到药用蛋白标准的人类抗体。植物来源的抗体在体外的稳定性和体内的生物活性与动物细胞培养来源的抗体是相同的，利用它将开发出一种低成本的治疗方法来防治某些由性传播的疾病。LargeScaleBiology公司和斯坦福大学已经合作开发了一种肿瘤特异性疫苗，可用于阻止细胞的恶性生长，它们利用植物病毒作为瞬时表达系统。治疗的目的是在患者体内产生特殊的抗体，它能特异性识别恶性生长的B细胞表面特异性位点，使靶细胞最终受到破坏，而正常的细胞不会受到任何影响。另外一个引起全球关注的研究成果是，瑞士联邦技术研究所,在2000年将水仙的八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶基因导入水稻，研制出一种富含β胡萝卜素（维生素A前体）的水稻，品种名称T309，每克稻米含1.6mg胡萝卜素，由于稻米色泽金黄，故称为“金色大米”。我国植物生物反应器的研究始于上世纪90年代初期，虽然在构建高效植物表达载体和培育转基因植物等主要技术环节上与国外相差无几，但在研究的广度和深度上与发达国家相比却存在很大差距。幸运的是，在制订“九五”，“十五”“863”计划时，选择了“利用转基因植物生产口服疫苗和生物可降解塑料”等研究课题予以资助。已取得较多的研究成果。我国植物生物反应器的研究和利用还主要集中在药用蛋白的研究和应用方面。而利用转基因植物生产特殊饱和或不饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精或糖醇、次生代谢产物、工农业用酶制剂的研究仍然没有引起国家足够的重视，其实，这些生物制剂的市场潜力也是非常可观的。如利用转基因玉米生产植酸酶，在加工成动物饲料添加剂后，可有效降低家畜排泄物中的磷含量，这对于降低水污染和保护生态环境方面很有意义。目前，利用重组DNA技术生产的大多数治疗用血液蛋白几乎都是在哺乳动物细胞表达系统中生产出来的。该系统的主要优点是所表达的重组蛋白能够进行正确的折叠及完成其他翻译后加工过程的机会比较高，然而，有许多因素仍然限制哺乳动物细胞表达系统的广泛应用，这些因素包括：1）即使在最适的培养条件下，重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平仍很低，通常为每天每升数十毫克；2）重组蛋白最后必需从培养液中分离提纯出来，这会进一步导致产量损失和增加生产成本；•3）哺乳动物细胞表达系统日常维护费用非常高，这也使产品的生产成本居高不下；4）哺乳动物细胞对外力比较敏感，而振荡培养通常又是工业化大规模生产所不可缺少的，这就使扩大生产规模变得相当困难；5）胎牛血清是哺乳动物细胞生长所不可缺少的，它的价格昂贵，而且不同批次之间成份相差很大，这些变化会导致细胞的生长情况不一致，进而影响到细胞发酵过程及下游的提纯加工过程；6）哺乳动物细胞对一些环境因素如温度、pH值、含氧量和次生代谢产物的变化非常的敏感，因此需要对培养条件进行精确的监控；7）利用哺乳动物细胞培养表达系统不能避免病原生物的污染。由于存在着上述限制因素，利用植物作为生物反应器生产具有临床应用价值的药用蛋白日益引起人们的关注。尤其是当重组蛋白需求量比较大，供给时间又是长期的话，利用植物表达系统很显然是一个不错的选择，它除了具备其它真核生物表达系统共有的那些优点外，还有一些是其它表达系统所不具备的。