病毒与噬菌体

第五节病毒与噬菌体疫苗•疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。•疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性：•当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。病毒一、概述二、病毒的形态结构和化学组分三、病毒的分类四、病毒的检测核酸(Nucleicacid)蛋白质衣壳(Proteincoat)（一）人类对病毒的发现和认识过程1892：俄国伊万诺夫斯基首次发现烟草花叶病毒的感染因子能通过细菌过滤器。1898：荷兰贝哲林克证实该致病因子可以被乙醇从悬液中沉淀下来而不失去其感染性但用培养细菌的方法培养不出来；给这样的病原体起名叫virus。1935：美国斯坛莱从烟草花叶病病叶中提取出了病毒结晶，又证实了结晶中含核酸和蛋白质两种成分，而只有核酸具感染和复制能力。1952：Hershey和Chase证实噬菌体的遗传物质仅仅是DNA,开创了病毒分子生物学。1971后：陆续发现了各种亚病毒—类病毒、朊病毒、拟病毒。（二）概况病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞型生物”，其本质是一种只含DNA或RNA的遗传因子，能以感染态和非感染态两种状态存在。病毒(virus)，拉丁语的原意是“毒素”。病毒和病毒颗粒、病毒粒、病毒体(virijon)是其同义词。1、没有细胞构造,其主要成分仅是核酸和蛋白质两种，故称分子生物;每一种病毒只含一种核酸,不是DNA就是RNA;2、本身不具有繁殖机制，靠其宿主代谢系统的协助来复制核酸、合成蛋白质等组分，然后再进行装配而得以增殖，形成子代；3、既无产能酶系,也无蛋白质和核酸酶合成系统，只能活细胞内专性寄生；4、形态极其微小,必须在电镜下观察,一般具过滤性;6、在离体条件下,能以无生命的化学大分子状态存在,并可长期保持其侵染活力;7、对一般抗生素不敏感,但对干扰素敏感。8、有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。（三）病毒特征（四）噬菌体：专性寄身于微生物的病毒，有三种基本类型。由核酸和蛋白质组成，侵入宿主体内会出现两种反应：裂解反应和溶源性反应。二、病毒（virus）的构造（一）病毒大小（二）病毒的形态构造（三）化学组成病毒粒子(virusparticle)：指成熟的、结构完整的、有侵染性的病毒个体。在电子显微镜下呈特定的形态。（一）病毒大小测定病毒大小的单位是纳米（10－9)，多数病毒的直径在100nm以下:50nm小型病毒50nm～150nm中等大小病毒（大多数）150nm大型病毒（最大300nm）绝大多数病毒是能通过细菌滤器,须用电镜才能观察到其具体形态和大小。病毒大小牛痘苗病毒传染性浓泡皮炎病毒腮腺炎病毒T偶数病毒疱疹病毒大蚊病毒流感病毒烟草花叶病毒腺病毒多瘤病毒脊髓灰质炎病毒1微米（二）病毒的形态多数病毒呈球形或近似球形，杆状，丝状，少数可为子弹状、砖块状，噬菌体可呈蝌蚪状。1、病毒粒子的基本结构衣壳核髓被膜刺突核衣壳衣壳粒病毒粒子结构模式图A结构简单的病毒粒子；B结构复杂的病毒粒子2、病毒的对称体制三类典型形态的病毒：•廿面体对称的结构(球状)•腺病毒•螺旋对称的结构(杆状)•烟草花叶病毒•复合对称的结构(蝌蚪状)大肠杆菌的T偶数噬菌体是由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成，是病毒中复合对称的代表。螺旋对称二十面体对称复合对称(A)Filamentous(B)Complex(C)Eicosahedral(D)EnvelopedRNAorDNAProteinCoat(Capsomers)Lipidenvelope病毒粒子的对称体制（1）螺旋对称的代表-烟草花叶病毒(tobacomosaicvirus,TMV)有三种类型：纤维状、直杆状和弯曲杆状。衣壳形似一中空柱，内包核酸，衣壳粒和核酸呈螺旋对称形排列。由95％衣壳Pr和5％SSRNA组成。蛋白质衣壳由衣壳粒（2130个）一个紧挨一个地呈螺旋排列而成，ssRNA位于衣壳内侧螺旋状沟中。（2）二十面体对称的代表－腺病毒(Adenovirus)具有20个面，30条边和12个顶角。核衣壳由不同数量的衣壳粒按一定方式排列成对称体。腺病毒粒子共由252个球形的衣壳粒排列成一个具有廿面的对称体，线状dsDNA。噬菌体X174只有12个衣壳粒，最大的廿面体是由1，472个衣壳粒组成的昆虫病毒粒子。绝大多数噬菌体为蝌蚪形，现以E.coliT4为例，介绍蝌蚪形噬菌体的结构：大肠杆菌T4噬菌体构造（3）复合对称的代表－T偶数噬菌体95nm95nm65nm24环颈环三、病毒的分类病毒在自然界分布广、数量多。几乎可以感染所有的生物，包括各类微生物、植物、昆虫、鱼类、禽类、哺乳动物和人类。根据宿主可以分为：动物病毒植物病毒微生物病毒（或称噬菌体）等四、病毒的检测包含体(inclusionbody)噬菌斑(plaque)空斑(plaque)枯斑(lesion)病毒的群体形态有：（1）包含体（inclusionbody）概念：感染病毒的宿主细胞内，出现在光学显微镜下可见的大小、形态、数量不等的小体，称为包含体。（在宿主细胞内形成包含体是病毒的特征，不同的病毒其形成的包含体具有不同的形态、结构和特性。）包含体在细胞中的形成部位：位于细胞核内—如包疹病毒；位于细胞质内—如狂犬病毒等；胞核内胞质都有—麻疹病毒包涵体（inclusionbody）是病毒的聚集体;是病毒的合成部位;是病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质包涵体的实践意义—-病毒鉴定、临床诊断依据。意义：(2)噬菌斑(plaque)噬菌斑是指在宿主细菌的菌苔上，噬菌体使菌体裂解而形成的空斑。应用：1、噬菌体定量计数2、噬菌体的鉴定（3）蚀斑和感染病灶在动物细胞培养物上的与噬菌斑类似的空斑,称为蚀班。（4）坏死斑：植物病毒在植物叶片上形成的群体称为坏死斑。四、噬菌体的形态与结构噬菌体：是病毒中的一种，一般把侵染细菌、放线菌、蓝细菌的病毒叫噬菌体，包括噬细菌体、噬放线菌体、噬蓝细菌体等。把侵染真菌的病毒叫噬真菌体。噬菌体在自然界广泛存在，在1995年发表的ICTV的病毒分类与命名第六次报告中共报道了4000余种，分别划归为49个病毒科。噬菌体共有3种形态。噬菌体的3种形态：噬菌体的繁殖分为：吸附、侵入、增殖（复制与生物合成）、成熟（装配）和裂解（释放）5个阶段。（一）噬菌体的繁殖裂解性周期（增殖性周期）：烈性噬菌体的繁殖过程。①吸附(adsorption)噬菌体对宿主细胞的吸附具高度的特异性。吸附的机理：尾丝尖端与受体发生共价结合。影响吸附的因素：噬菌体数量；阳离子浓度；温度；辅助因子（生物素）等。自外裂解：大量噬菌体吸附在同一细胞表面并释放众多的溶菌酶，最终因外在的原因导致细胞裂解。②侵入(penetration)头部的核酸通过中空的尾髓压入细胞内，而蛋白质外壳则留在细胞外。尾鞘的收缩性可明显提高噬菌体核酸注入的速率。③增殖(replication)包括核酸的复制和蛋白质的生物合成。增殖是通过噬菌体基因表达实现的。核酸的复制与病毒蛋白质的合成是分开进行的。病毒核酸链接入寄主核酸链病毒核酸复制病毒核酸的复制④成熟（装配）已合成的各部件进行自行装配成新的噬菌体的过程。T偶数噬菌体装配过程模式图被感染细胞裂解，成熟的子代噬菌体转移到外界。开始新的生活史。⑤裂解（释放）裂解量：平均每一宿主细胞裂解后所产生的子代噬菌体数。有囊膜病毒以“出芽”方式释放（二）噬菌体与寄主的关系温和噬菌体（temperatephrage）——噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（插入）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。烈性噬菌体（virulentphage）——感染细胞后,能在寄主细胞内增殖，产生大量子代噬菌体并引起细菌裂解的噬菌体。（1）一步生长曲线的基本实验步骤离心术抗噬菌体血清培养定时取样测噬菌斑数以培养时间为横坐标，以噬菌斑数为纵坐标，绘出的曲线为一步生长曲线。（三）噬菌体增殖规律的描述方法—一步生长曲线定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。（2）一步生长曲线的三个阶段:潜伏期、裂解期、平稳期1）潜伏期噬菌体的核酸侵入宿主细胞至第一个成熟噬菌体粒子装配前的一段时间。2）裂解期紧接在潜伏期后的宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。3）平稳期感染后的宿主细胞已全部裂解，溶液中噬菌体数量达到最高点的时期。21000温和噬菌体特点游离态温和整合态(原噬菌体）营养态具有整合能力；具有同步复制能力；都是dsDNA;4、溶源性溶源性：温和噬菌体侵入宿主细菌细胞后，由于其核酸整合到宿主核基因组上，并随宿主核酸同步复制，并不引起宿主细胞裂解的特性。子代均具有溶源性。温和噬菌体存在形式溶源性与溶源性细菌•溶源性细菌：含有原噬菌体的细菌称为溶源性细菌（lysogenicbacteria）或溶源化细胞(lysogeniccell)。溶源菌是一类能和温和噬菌体长期共存，一般不会出现有害影响的细胞。•溶源性（溶源现象）：是温和噬菌体侵入宿主细菌细胞后，由于其核酸整合到宿主核基因组上，并随宿主核酸同步复制，并不引起宿主细胞裂解的特性。•凡能引起溶源性的噬菌体即为温和噬菌体。•溶源性广泛存在于各种细菌中，如大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、链球菌、芽孢杆菌、棒杆菌、弧菌和极毛杆菌等。•溶源性菌株命名：在敏感菌株的名称后面加一括号，其中写上溶源性噬菌体，例如E.coliK12(λ)。溶源性细菌的测定1）将少量溶源菌与大量敏感性的指示菌相混合；2）与琼脂培养基混匀后倒平板；3）经培养后溶源菌长出如图菌落。噬菌体的应用噬菌体会给人类造成损失，利用微生物进行发酵的工业常深受其害。但是，由于噬菌体的某些生物学特性，使其在人类的生产实践和生物学基础理论研究中都有一定价值。可概括为以下几方面。1)用于鉴定未知细菌在医学上，有些难鉴别的病原菌，利用噬菌体对宿主细胞的高度专化性的敏感性，不仅可鉴定到菌种，而且可鉴定到菌型。2)用于临床治疗某些传染性疾病。如果将噬菌体制剂与抗生素或者磺胺药物配合应用，则效果更好。3)检验植物病原菌利用噬菌体可以检验由种子携带的植物病原菌。4)测定辐射剂量某些噬菌体(如T2)对辐射剂量的反应敏感而精确。5)噬菌体在分子生物学研究中的作用噬菌体现已成为进行分子生物学研究的较为理想的重要材料。（二）植物病毒已知的植物病毒多达700种（1989年），多数是ssRNA病毒。形态：杆、丝、球状，一般无包膜。1619年荷兰画师描画的有病郁金香的画像。花叶、黄化或红化等症状植株发生矮化，丛枝或畸形等形成枯斑或坏死等症状植物黄萎病植物感染病毒后的主要症状借昆虫刺吸式口器进入、通过伤口或嫁接进入，再通过胞间连丝或输导组织迅速向其它部位扩散引起普遍感染。1、“侵入”方式3、核酸的复制和蛋白质的合成2、脱壳植物病毒侵入宿主细胞后才能发生脱壳。增殖过程4、装配（成熟）（三）人类和脊椎动物病毒在人类与脊椎动物中广泛寄生着相应的病毒。人类传染病80％由病毒引起（＞300种），脊椎动物病毒＞900种，许多病毒引起人畜共患病。另一些病毒感染动物后，并不致死宿主细胞，而是引起肿瘤。种类dsDNA、ssDNA、dsRNA、ssRNA。衣壳外有的有包膜，有的无包膜，有的包膜上有刺突。病毒感染的防治接种疫苗、生物制剂、中药预防、干扰素等。增殖过程与噬菌体的增殖大致相同，可分为五个连续步骤：1）吸附具高度专一性地吸附于敏感细胞表面的受体。2）侵入以胞饮、包膜溶入细胞膜、特异受体转移等方式侵入敏感细胞内。3）脱壳脱去衣壳和包膜。4）生物合成核酸的复制和蛋白质的合成。5）装配和成熟分别合成的核酸和蛋白质组合成完整的、新的病毒粒子。6）释放大量有侵染性的子代病毒。多角体：多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成光镜下呈多角形的包涵体。直径一般3μm（0