酵母RNA的提取

酵母RNA的提取1、实验目的•1、掌握稀碱法提取RNA的原理和方法•2、学习和了解其它提取RNA的方法和原理2、实验重点和难点•离心机的使用•提取RNA的实验原理3、实验原理•一般的生物细胞中同时含有DNA和RNA，在酵母中RNA比DNA的含量高得多，RNA（2.67～10.0%），DNA则少于2％(O.03％～O.516％)，在实验室常用酵母作为RNA提取的材料。若要制备具有生物活性的RNA，可采用苯酚法、去污剂法和盐酸胍法等，最常用的是苯酚法提取RNA；若对生物活性没有要求，则可使用浓盐法，稀碱法等。工业中用稀碱法或浓盐法，主要用于制备核苷酸的原料.•苯酚法：组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。•浓盐法：在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA释放出来，再利用等电点（pH为2.0～2.5）沉淀。此法易掌握，产品颜色较好。盐浓度需要控制，太低，RNA不易从细胞中释放出来，太高，细胞急剧收缩不利于抽提。一般80～120g/L为宜。•稀碱法：利用细胞壁在稀碱条件下溶解，使RNA释放出来，这种方法提取时间短，但RNA在稀碱条件下不稳定，容易被碱分解；•本实验采用的稀碱，既可加速细胞的破裂，又可增大RNA的溶解度。当碱被中和后，可用乙醇(或者异丙醇）将RNA沉淀，或用等电点沉淀RNA(应严格控制pH,缓慢调),此为RNA的粗品。•核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基水解•（1）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。•（2）磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀[(NH4)3PO4·12MoO3↓],有还原剂存在时，形成蓝色钼蓝。•(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4•H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O•H3P(Mo3O10)4Mo2O3•MoO3（钼蓝）•还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当无机磷含量在1—25μg范围内，光吸收和含磷量成正比。•RNA的含磷量为9.5%，即1μgRNA磷相当于10.5μgRNA。DNA的含磷量平均为9.9%。Vit•C•（3）地衣酚(苔黑酚）显色法：RNA与酸共热时降解，形成戊糖，继而形成糠醛（α-呋喃甲醛），糠醛与地衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应，形成鲜绿色复合物，可用比色法测定。当核糖核酸浓度在10～100μg/ml范围内，其浓度与吸光度成线性关系需要FeCl3或Cu2+作催化剂。4、实验操作(一)RNA的提取（1）称5g干酵母粉于150ml三角烧瓶中，加25mlO.2％的NaOH，沸水浴中搅拌提取20min。冷却后滴加乙酸使其略偏酸性，pH约5-6，目的是去除蛋白质。（2）离心(4000r／min，13min)，去除沉淀。上清液冰浴。（3）向上清液中加入20ml（约上清液的两倍体积）95％乙醇，稍搅拌后静置（冰浴约10min）。待完全沉淀后离心(4000r／min，15min)，去上清液。（4）沉淀用95％乙醇洗两次（如沉淀浮起需再次离心），每次约10mL;用乙醚洗两次，每次10mL。目的是去除脂溶性物质和水，乙醚的沸点比乙醇的低，所以最后加乙醚有利于沉淀的干燥。(二)RNA的鉴定取沉淀约1g，加10ml10％H2SO4→沸水浴中加热30min。•（5）．嘌呤碱取水解液2mL加入2mL浓氨水，然后加入约1mL5%硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。（慢慢加入嘌呤碱时，沉淀上浮，摇匀，沉淀下沉）•（6）．核糖取1支试管加入水解液0.5mL、1mL苔黑酚三氯化铁浓盐酸溶液。放沸水浴中2分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。时间久了会有黑色沉淀，是浓度高，产物结晶出来了。5、注意事项•避开磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围20～70℃，防止RNA降解。在90～100℃条件下加热可使蛋白质变性，破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶，有利于RNA的提取。•在调pH值时，一定要缓慢小心，且要在低温下进行。•在洗涤时，要用乙醇洗涤，且不可用水洗，否则将导致RNA部分溶解而造成损失，降低RNA提取率。•提取RNA时必须用沸水浴，并经常搅拌，NaOH必须实现预热。•用乙酸调pH5～6必须有，目的可以除去一些杂质。•最后过滤前必须将乙醇沥干，不能带水，否则RNA会粘在滤纸上，无法取下。也可以采用离心的方法。•所得RNA粗品应是浅黄色粉末状。6、原始数据•记录实验过程中的现象7、讨论•7.1、用稀碱法提取酵母RNA的过程中需注意什么？•7.2、鉴定RNA的原理？