菌种选育

菌种是发酵工业的基础，是发酵工业的关键。获得微生物和新产物，关键是：①、选择合适的微生物源；②、建立科学的筛选方案(检测系统)。要求：选择性强、灵敏度高。（一）微生物是生物产物的主要来源之一一、生物物质产生菌的筛选微生物是各种活性产物的源泉，资源丰富。医药50％的化合物与天然产物有关。微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。合适的微生物源一、工业生产常用的微生物及要求（一）微生物的特点1、种类多，分布广2、高面积-体积比，代谢能力强3、生长迅速，繁殖快4、适应性强，容易培养5、易变异微生物指是指那些个体微小，结构简单，必须借助显微镜的帮助才能看清它们外形的一群微小生物。最常用的工业微生物细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌最常用的工业微生物酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌：点青霉、产黄青霉桔青霉根霉属德氏根霉米根霉、小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉最常用的工业微生物最常用的工业微生物放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌未培养微生物定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99％。研究方法模拟自然培养法:原位培养、培养条件优化、单细胞操作、宏基因组分析法二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求（二）分离筛选原理与技术（三）应用举例1.菌种选择的总趋势野生菌→变异菌自然选育→代谢控制育种诱发基因突变→基因重组的定向育种2.菌种选择的要求能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。（二）分离筛选原理与技术1.筛选的指导思想2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面3.新种分离筛选原理与技术1.筛选的两种指导思想先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。结果有两种可能：获得适于工业发酵菌株只获得选育所需的出发菌株2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；生产中长期使用的菌种的定期分离筛选；从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株；从已知菌种和大自然中分离新菌株寻找新的发酵产品的产生菌；寻找老产品的新的优良菌株。从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：经济性指导性设计筛选方案时必须考虑两个要点选择性灵敏度3.新种分离与筛选的步骤样品采集→样品的预处理→目的菌富集培养→菌种初筛→菌种复筛→菌种发酵性能鉴定→菌种保藏。3.新种分离与筛选的步骤调查研究（查阅资料）试验方案设计样品采集（所需微生物？）样品预处理（目的微生物）菌种分离选择分离随机分离富集培养固体培养菌种纯化复筛菌种纯化初步工艺条件摸索，生产性能测试较优菌株1-3株保藏，诱变出发菌株必要的毒性实验初筛根据目的菌株及其产物特点选择压力，定向筛选选择性分离方法大致可分为五个步骤（放线菌的分离为例）：微生物选择性分离的原理(筛选系统)①、含微生物材料的选择；②、材料预处理；③、所需菌种分离；④、菌种培养；⑤、菌种纯化。1.含微生物材料的选择采样时应注意的问题:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情况采样季节土壤的酸碱度菌种来源选择标准：1、土壤来源广泛：天然材料（土壤等）来源越广泛，含有目的菌的可能性越大，获得新菌种的可能性越高；2、在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种。例：从被污染的实验室培养基中分离出嗜盐菌，从盐场分离出嗜盐链霉菌。含微生物材料的选择3、利用同一生态环境内的不同环境条件分离出更多种类的菌株。例如：酸性土壤圈的放线菌类群与其紧接下层的中性圈的放线菌类群有很大不同。4、自然环境的菌群可因人类的活动而改变。例如：于土壤中加入去莠津会导致放线菌菌群数量的增加。如诺卡氏菌属能生长在Carboxanilide杀真菌剂中。5、更新的生态环境仍有待开发。例如，从Componia的根瘤中分离出一株放线菌；从白蚁肠子里分离出一株类似放线菌的细菌。2.样品的预处理目的：提高分离效率方法：物理方法：热处理；膜过滤法；离心法化学方法诱饵法材料的预处理（1）、物理法①、热处理：可减少材料中的细菌数。因许多放线菌比细菌细胞耐热。②、膜过滤：样品中细胞数较少时(如水)，可采用膜滤法浓缩。滤膜的品种对收集菌的类型有重要的影响。③、离心法：处理放线菌繁殖体含量很低的海水，可先将样品离心后再过滤。④、搅动释放孢子法：收集腐烂稻草和其他植物材料中的嗜热放线菌孢子可在空气搅动下进行。并可用一风筒或一简单的沉淀室收集孢子。然后，用取样器将空气撞击在含培养基的平板上。这样可以减少分离平板中的细菌数目。（2）化学法在分离前加一些固体基质(把几种基质加在土壤中)或洒些可溶性养分来强化培养基。加几丁质或碳酸钙、提高pH（3）诱饵技术将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。如：花粉、蛇皮、人的头发、涂石蜡的棒①、广泛使用石蜡棒技术来分离诺卡氏菌；②、从土壤中分离耐酸放线菌。③、有人用花粉诱饵从土壤中分离出13株小瓶菌，其中有些是新种或亚种。分离方法的选择根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法菌种的营养特征独特生长特征独特无选择性特征根据产物的特征进行随机分离选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。选择性分离选择性分离原理和技术生长条件的选择与控制原理控制营养成分控制培养基酸碱度添加抑制剂控制培养温度控制通气条件选择性分离技术施加选择压力，进行定向筛选所需菌种的分离取决于分离培养基的养分、pH值和加入的选择性抑制剂。一般凭经验而不是绝对的选择。1、选择合适分离培养基①、几丁质培养基：分离土壤和水中放线菌。但测试过的500株链霉菌和其他放线菌中，只有25％的菌种具有强的水解几丁质的能力。许多放线菌生长在能利用几丁质的可作为放线菌碳与氮源的“食腐菌”上，而其本身却不利用几丁质。广泛应用的选择培养基。②、淀粉-酪素培养基：长出的放线菌种类与几丁质培养基上生长的相似，但其菌落的密度更大、色素更多，同时细菌也容易生长。这种培养基中加入4.6％(m/m)的NaCl，有利于链霉菌生长，但不是所有的链霉菌都能耐受这一浓度的NaCl。大多数放线菌都是嗜中性的，分离培养基的pH通常在6.7～7.5之间。分离嗜酸放线菌，宜pH4.5～5.0。有人从碱性的加拿大土壤中分离出嗜碱链霉菌，不能在pH6.1～6.8下生长。估计嗜碱性放线菌也可能存在于其他碱性环境中。2、选择合适的pH3、加入选择性抑制剂筛选放线菌时，可加入抗真菌抗生素，但不能用抗细菌抗生素，因放线菌对它敏感。如分离种类较广的放线菌，在分离培养基中加抗细菌抗生素时会使得放线菌及其细菌的数量同时减少，但如果分离的种类不那么广，可加入放线菌能耐受的抗生素，如培养基中加入新生霉素(25µg/mL)和亚胺环己酮(50µg/mL)能分离出普通高温放线菌。温度和时间两方面，主要变量为时间。培养温度：放线菌25～30oC，嗜热菌45～55oC，嗜冷菌4～10oC。培养时间：是培养的主要变量，嗜温菌（链霉菌和小单孢菌）7～14d；嗜热菌（高温放线菌）1～2d。注意：有时培养时间短会漏掉一些新的和不寻常的菌株，有人在30oC和40oC将培养1个月，分离出不寻常的种属。也有人在20oC培养6周从海水中获得放线菌。菌种的培养菌落的选择（筛选方法）分离步骤中最容易受挫折和最耗时间的阶段。选择方法取决于筛选的最终目的。菌落的选择有三种方法：显微镜观察分离铺菌法复印平板法显微镜观察分离不易区分同一属的不同种。铺菌法会使所需菌落污染，并且只能每平板一种试验菌复印平板法对不生长孢子的链霉菌则不能使用，也不适用于游动细菌的筛选。铺菌法于平板上铺一层试验菌，观察抑菌圈大小，可测定抗生素生产能力。缺点：所需要的菌落易污染，且只能在每个平板上铺上一种试验菌。放线菌常用筛选方法：A.富集液体培养增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件培养方式分批培养方式：以最大比生长速率（μmax）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题连续培养方式：以比生长速率（μ）筛选μABS0基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响当SS0时，富集什么菌株？当SS0时，富集什么菌株？连续富集培养技术分离菌株的优点分离的菌株特别适合连续发酵生产过程有利于分离具有某种工业生产特性的菌株可以筛选出能共生的稳定混合培养物B.固体培养技术常用于分离某些酶产生菌选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质随机分离原理与技术从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出目的菌。技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。随机分离技术举例抗生素产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选多糖产生菌的筛选高产培养基设计的几个原则制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻遏；确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH缓冲剂以减少pH变化；前体、促进剂及抑制剂的采用。抗生素产生菌的筛选筛选模型：试验菌筛选方法：固体培养基液体培养筛选抗药性筛选筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同III无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶铺菌法复印平板法（1）抗生素产生菌筛选在含有敏感菌的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培养基中，检测抗菌活性。采用联合试验菌。举例：枯草杆菌和绿色产色链霉菌可以分离出对枯草杆菌抗菌活性低、对绿色产色链霉菌活性高的新抗生素。黄色霉素族的抗生素便是用这类方法找到的。试验菌代表微生物类型金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌枯草杆菌革兰氏阳性杆菌大肠杆菌革兰氏阴性肠道细菌分枝杆菌结核杆菌白色念珠菌酵母状真菌青霉菌丝状真菌药理活性化合物产生菌的筛选药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到治疗的目的。筛选模型：目标酶1.微生物来源的酪氨酸蛋白激酶抑制剂（李靓，2007）2.Biochemicalstudyofanew{beta}-lactamaseinhibitor-resistantenzyme(SHV-84)producedbyaclinicalEscherichiacolistrain.（ManageiroV,2010）3.α-糖昔酶抑制剂SH-9766产生菌的筛选和鉴别(孙敏，2005)4.几丁质酶抑制化合物产生菌的筛选初探（谢洁，2006）生长因子产生菌的筛选筛选模型：营养缺陷型试验菌筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长氨基酸产生菌的筛选样品预处理初筛（除真菌）在分离平板上生长获得多个单菌落再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸UV杀死长好的菌落培养后产氨基酸菌落周围有生长圈找到目的菌落目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定筛选产量含量高的菌株复印平板多糖产生菌的筛选取样特点：碳水化合物工业的废弃物筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。细菌分离：以乳酸菌为例取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中加麦芽汁至瓶口处，