细胞生物学实验技术二

细胞生物学实验技术（二）(3)无菌无菌操作：超净工作台、火焰消毒等培养液中加入抗菌素器械、溶液消毒（烤箱、高压灭菌、过滤）(4)其他温度37℃湿度100%CO2浓度5%2.细胞培养的传代原代培养:直接取材于有机体的细胞培养取材切割消化培养传代培养:将原代培养存活的细胞从培养瓶中取出，以1:2以上的比例扩大培养原代培养传代培养(保持分化特性)传代3.细胞系（Cellline）在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无限繁殖能力，能够无限传代的细胞群。变异细胞细胞系HeLa人宫颈癌上皮细胞3T3小鼠成纤维细胞无限繁殖4.细胞融合（Cellfusion）（1）定义在自然或人工条件下，使二个或二个以上细胞合并形成一个细胞的过程。异核体杂交细胞分裂（2）促融方法生物学方法：仙台病毒化学方法：PEG物理方法：电脉冲打孔仪（3）应用A细胞核和细胞质间的相互作用B膜蛋白的流动性C基因定位D单克隆抗体制备B淋巴细胞肿瘤细胞MousecellHumancelldivisionE细胞周期相关因子的发现四、细胞组分的分级分离通过逐级分离对细胞内细胞器和各种成分的化学性质和功能进行研究的方法。匀浆分级分离分析匀浆液膜细胞器大分子低渗超声去污剂强制过滤研磨细胞破坏（一）离心法用于分离细胞器和大分子(1)差速离心法分离对象:不同大小和形状的组分（细胞核、细胞器）具体方法:由低速到高速逐级沉降(repeat)(2)速度沉降法分离对象:不同大小、形状的组分(沉降系数S)比差速离心方法更精细具体方法:在离心管中予装5%-20%蔗糖梯度的离心介质(3)平衡沉降法分离对象:密度不同的组分（与大小、形状无关）具体方法：在离心管中予装一定密度梯度的离心介质（20%-70%蔗糖、CsCl）通常采用超速离心（二）层析法（柱层析）主要用于分离、纯化蛋白质填充柱填料（固定相）流动相1.离子交换层析层析介质:阴离子或阳离子树脂分离原理:电荷2.凝胶过滤层析层析介质:凝胶分离原理:分子大小3.亲和层析层析介质:基质+抗体底物分离原理:亲和性4.高压液相层析HPLC基质粒度小（3-10μm）、分辨率高、分离速度快(三)电泳法主要用于分离蛋白质、核酸1.琼脂糖凝胶电泳分离对象:核酸支持介质:琼脂糖凝固点40-45℃不同浓度凝胶具有不同孔径电泳缓冲液:TAE\TBE染料:溴化乙锭EB(三)电泳法主要用于分离蛋白质、核酸1.琼脂糖凝胶电泳分离对象:核酸支持介质:琼脂糖凝固点40-45℃不同浓度凝胶具有不同孔径电泳缓冲液:TAE\TBE染料:溴化乙锭EB2.SDS-PAGE分离对象:蛋白质(蛋白质分子量、亚单位组成)样品处理:SDS阴离子表面活性剂β-巯基乙醇还原剂大小电荷形状支持介质:丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺染色:考马斯亮蓝银染特异性蛋白(westernblotting)SDS-PAGE3.双向电泳根据蛋白质分子量、等电点分离等电聚焦:等电点SDS:分子量4.Western印迹技术将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜,然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定蛋白条带将与抗体结合,并进一步与酶标记二抗或生物素标记二抗反应,最终以发色底物显色而被检测.基本步骤:(1)SDS-PAGE(2)转膜(3)抗体反应一抗孵育标记二抗孵育(4)显色westernblotting5.质谱技术通过测定样品（分子被电离汽化）离子的质/荷比来进行成分和结构分析的方法蛋白质质量生物大分子的相互作用2002年诺贝尔化学奖获得者电喷雾电离electrosprayionization软激光解吸电离softlaserdesorption五、细胞内分子的示踪技术用一定的方法显示细胞中的分子,并对其在细胞内的代谢过程进行追踪.(一)同位素示踪技术1.原理同位素:核外电子数相同化学性质相同原子核重量不同放射性同位素:衰变2.应用(1)条件可检测、可摄入(2)方法放射自显影（autoradiography）蛋白质-aaDNA-TRNA-UA放射性物质脉冲掺入活细胞B不同时间取样切片C暗处曝光D显影、定影(二)抗体示踪技术1.单克隆抗体（monoclonalantibody）B淋巴细胞肿瘤细胞2.抗体+荧光染料LM3.抗体+电子致密物EM六、细胞分子生物学技术1.聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）特异性体外DNA扩增技术利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板，以dNTP为原料，在DNA聚合酶作用下进行的DNA体外合成技术。（1）反应体系：模板链DNA聚合酶dNTP引物（primer）（与模板相应序列互补）（2）反应步骤：变性94℃退火55℃延伸72℃2.核酸分子杂交(1)Southernblotting–DNA将凝胶分离的DNA转移到固相支持膜上,然后与存在于液相中的标记探针进行杂交,以检测特定DNA序列的技术.(2)Northernblotting–RNADNADNARNADNARNARNA特异性探针A基因组DNA的消化B琼脂糖凝胶电泳分离C转膜D杂交E放射自显影(3)原位杂交技术（insituhybridization）用核酸探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交，以检测特定核酸分子在细胞内原有位置的方法。FISH3.基因转移技术应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源基因转移到受体菌或细胞内，并使其在细胞内实现转入基因的扩增或表达。外源基因细菌转化真核细胞转染基因扩增蛋白质表达载体(1)限制性核酸内切酶限制性内切酶：识别DNA分子内由4～8个碱基构成的特定序列的酶，这些酶的识别位点大多是“回文”序列。粘性末端平滑末端(2)质粒载体克隆(3)克隆基因的表达在细菌中的表达在动物细胞中的表达4.抑制基因表达技术研究基因功能及调控疾病的防治反义核酸技术根据碱基互补配对原理,利用人工或生物合成特异互补的DNA或RNA片断,抑制或封闭基因表达的技术.作用方式直接导入载体转染RNA干扰技术将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA导入细胞，使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。起始阶段：双链RNA导入细胞siRNA(21-23)（shortinterferingRNAs）效应阶段：RNA诱导沉默复合物RISC解链结合mRNA（RNAinducedsilencingcomplex）（降解）DicerATP