细胞生物学植物组织培养实验方案

[组织培养]2015-1111[键入公司名称]|细胞学实验之植物组织培养1细胞学实验之植物组织培养参考参考一、实验目的：1.学习和配制植物组织MS固体培养基；2.学习和使用高压蒸汽灭菌锅灭菌；3.了解和掌握无菌操作；4.将胡萝卜贮藏组织培养成胡萝卜幼苗。二、实验原理：细胞全能性(celltotipotency)：植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。植物的任何细胞、组织和器官，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和生长调节剂等组成的培养基中，使其生长、分化、形成完整植株的过程，称为植物组织培养。三、实验器材：1、实验材料：新鲜的质量良好胡萝卜肉质根。2、实验设备（1）仪器设备：冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、搪瓷杯、药勺、称量纸、玻棒、标签纸、电磁炉，三角瓶、医用口杯、精密pH试纸（pH5.4~7.0）、药勺、封口膜、牛皮纸、橡皮筋、棉线、电炉、高压蒸汽灭菌锅、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、酒精棉球、小块纱布、灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、摇床（震荡培养箱）等。其中主要仪器设备为灭菌锅，超净工作台，恒温培养箱等。（2）药品硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA（α-萘乙酸）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、KT、浓盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、重铬酸钾、95%酒精、蒸馏水、MS培养基母液化学组分、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、75％酒精、0.1%HgCl2。MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、愈伤组织继代培养基、75％酒精。四、实验步骤：实验总体流程：[组织培养]2015-1111[键入公司名称]|细胞学实验之植物组织培养21.MS培养基母液的配制与保存（一）母液的配制：母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10—100倍。1、MS大量元素母液（10×）称10升量溶解在1升蒸馏水中。配1升培养基取母液100ml。化学药品1升量10升量（10×）50升量（50×）①NH4NO31650mg16.5g②KNO31900mg19.0g③CaCl2·2H2O（CaCl2）440mg（）4.4g④MgSO4·7H2O（MgSO4）370mg（）3.7g⑤KH2PO4170mg1.7gMS培养基母液的配制与保存胡萝卜愈伤组织器官分化培养胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（接种和初代培养）MS固体培养基配制胡萝卜愈伤组织继代增殖培养胡萝卜愈伤组织培养取材与消毒培养基与接种用具的灭菌胡萝卜幼苗培养[组织培养]2015-1111[键入公司名称]|细胞学实验之植物组织培养32、MS微量元素母液（100×）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。化学药品1升量10升量100升量（100×）①MnSO4·4H2O（MnSO4·H2O）22.3mg（21.4mg）223mg（214mg）②ZnSO4·7H2O8.6mg86mg③H3BO36.2mg62mg④KI0.83mg8.3mg⑤Na2MoO4·2H2O0.25mg2.5mg⑥CuSO4·5H2O0.025mg0.25mg⑦CoCl2·6H2O0.025mg0.25mg注意：CoCl2·6H2O和CuSO4·5H2O可按10倍量（0.25mg×10=2.5mg）或100倍量（25mg）称取后，定容于100ml水中，每次取10ml或1ml，即含0.25mg的量。3、MS铁盐母液（100×）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。化学药品1升量10升量100升量（100×）Na2·EDTA37.3mg373mgFeSO4·7H2O27.8mg278mg注意配制时，两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热。混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。4、MS有机物母液（100×）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。化学药品1升量10升量100升量（100×）①烟酸0.5mg5mg②盐酸吡哆素（VB6）0.5mg5mg③盐酸硫胺素（VB1）0.4mg4mg④肌醇100mg1g⑤甘氨酸2.0mg20mg5、生长调节剂单独配制，浓度为1—5mg/ml（书中为0.5—1mg/ml），本实验要求配成1mg/ml。配制培养基母液时注意事项：①一些离子易发生沉淀，可先少量水溶解，在按配方顺序依次混合；②配制母液时用蒸馏水或重蒸馏水；③药品应用化学纯或分析纯；④溶解生长素时，可用少量0.1—1N的NaOH或95%酒精溶解，溶解分裂素类用0.1—1N的HCl加热溶解（如再加蒸馏水，易产生白色沉淀，此时可加入热水）。（二）母液的保存[组织培养]2015-1111[键入公司名称]|细胞学实验之植物组织培养41、装瓶：将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩倍数、日期、配制者。（注意将易分解、氧化者，放入棕色瓶中）例如：MS铁盐（100×）2、贮藏：4℃冰箱。（三）注意事项1．6-BA，NAA用量甚微，取用时要使用移液管，移液管越小越精确。2．注意配制大量元素母液时防止钙盐与硫酸盐和磷酸盐产生沉淀；3．铁盐母液用棕色瓶保存。注意pH的调节；2.MS固体培养基配制1L固体MS培养基配制：（1）用量筒从各种母液中分别取出所需的用量：MS大量元素母液100ml，MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机物母液各10ml。（2）用电子天平称出8g琼脂粉和30g蔗糖放在烧杯中，加入少量的蒸馏水在微波炉中加热使之溶解。（3）再用移液器取适量的6－BA和NAA放入组培瓶里。各种类型的培养基：基本培养基：MS0，即:MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；诱导愈伤组织培养基有2种，分别为MS0+0．1mg/L2，4-D和MS0+2mg/L2，4-D+0．2mg/L6-BA（本次实验采用后者）；（4）最后用蒸馏水定容到1L；用1mol/LNaOH或1mol/LHCL溶液调节培养基的pH值至5.8～6.0。（5）尽快分装，培养基占容器的1/5--1/4为宜（20-25mL），尽量避免培养基沾到容器内壁或容器口，标记日期。（6）用橡皮圈和牛皮纸封口。3.培养基与接种器材的灭菌1、洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管、烧杯等玻璃器皿（根据实际需要）进行彻底清洗。自然晾干或烘箱干燥。2、包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。3、无菌水：用洗净的2个500mL锥形瓶分别装取400mL蒸馏水，用牛皮纸封口。4、装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。（切忌干烧！）5、装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的锥形瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。6、灭菌：将排气阀开着，加热，直至锅内释放出大量水蒸气（此时水蒸气横向喷出），再关闭阀们；或者当锅内压力升至49.0KPa时，开启排气阀，将锅内的冷空气全部排出。当锅内压力达到108KPa时，温度为121℃时，维持15-20分钟，即可达到灭菌的目的。（若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。）切断电源，让灭菌锅自然冷却。7、70%酒精的制备与75%的酒精棉的制作。[组织培养]2015-1111[键入公司名称]|细胞学实验之植物组织培养5注意事项：1.灭菌时间和压力、温度的控制；2.先打开放气阀，等到压力显示为0时，再打开锅盖；3.分装要干净，灭菌时锥形瓶尽可能放正，不要使培养基流出；4.若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效；5.开盖后应尽快转移培养瓶，使培养瓶冷却、凝固。一般应将灭菌后的培养瓶储藏于30℃以下的室内，最好储藏在4-10℃的条件下。4、愈伤组织诱导培养接种环境1、先用75%酒精擦拭超净台的内部6个面。2、将现配的75%的酒精、0.1%的升汞溶液、刀、镊子、无菌纸、无菌水、小烧杯、培养皿、废液缸、试管架、打火机等操作用的工具放置到相应位置。3、将酒精灯添加适当的酒精（不超过容积的2/3），并检查是否可以点燃。4、先开紫外灯40min，后再通风20min。5、进入操作台的物品都要经酒精消毒。接种1、在无菌操作台上操作。2、点燃酒精灯，倒平板。3、消毒外植体：把清洗好的胡萝卜块根放入无菌操作台，消毒先用70%酒精对胡萝卜直根消毒5min，再用0.1%的升汞溶液消毒10min，用无菌水冲洗3次，放入成有无菌水的烧杯中待用。4、拆刀镊，先放在盛有工业酒精浸泡的管口瓶中，使用时在酒精灯的火焰上灼烧灭菌。5、切外植体：用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度3~5mm左右的小圆片，然后如图所示切，将韧皮部和木质部切去，留下形成层。6、接种外植体，4~5个/培养皿：打开牛皮纸时三角瓶瓶口应该倾斜并靠近酒精灯火焰，接种时，要求悬空放入，不要接触三角瓶的内壁，胡萝卜在培养基上要摆放位置。在揭开封口和封口时，可以将三角瓶口放在火焰上灼烧一下。7、用橡皮圈和牛皮纸封口。8、贴上标签纸。注意事项：1.在接种过程中，手不能接触外植体；2.每次接种前做好接种工具的灭菌工作；3.可以对手进行多次的消毒处理；4.实验废液不能随意处置，需要收集后进行专门处理。[组织培养]2015-1111[键入公司名称]|细胞学实验之植物组织培养65、胡萝卜愈伤组织继代增殖培养1.胡萝卜细胞悬浮培养培养基的配制（1）配方：MS基本培养基+2.0mg/LNAA+0.1mg/L6—BA+200mg/L水解酪蛋白+3%蔗糖（2）配制流程：（同胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制）。2.准备工作接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镊子、已经灭菌的培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；材料的准备（选择装有无污染的已经分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放在干净工作台上）3.愈伤组织的继代培养将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上产生的愈伤组织剥离转移接到愈伤组织继代培养基上，放置于25℃全黑的暗条件下进行愈伤组织的增殖培养，摇床上震荡培养以分离得到单细胞。已获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。6、愈伤组织器官分化培养（1）准备工作①接种室的清洁和消毒；②超净工作台的开机和消毒；③剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；④实验材料的准备（选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于净工作台上）；⑤无菌条件下，用镊子夹取胡萝卜肉质根愈伤组织，置于一个皿底铺有无菌滤纸的培养皿内，用解剖刀挑取愈伤组织上活跃生长的部分用于接种。（2）挑选色泽淡黄、松散、生长旺盛的愈伤组织接种于分化培养基上，于光暗比14h∶10h、25℃条件下培养约30d，诱导不定芽的产生。（3）配方：MS基本培养基＋0.1mg/LNAA＋1mg/L6-BA＋0.7％琼脂＋3％蔗糖（配制方法同上）。7、胡萝卜幼苗培养待生根植株形成一定量的根系并长至6～7片叶时，进行炼苗。炼苗约7d后开启瓶盖，在超净台上将其拔出，用无菌水轻轻冲洗除去根系上的培养基，再移入装有土的盆钵中，再进行常规栽培管理。五、实验结果2015.10.21~2015.11.23胡萝卜植物组织培养之胡萝卜愈伤组织培养；[组织培养]2015-1111[键入公司名称]|细胞学实验之植物组织培养72015.11.23~2015.12.胡萝卜植物组织培养之胡萝卜愈伤组织分化培养；实验图片：2015.10.212015.11.022015.11.162015.11.232015.11.302015.12.072015.12.149、参考文献[1].李浚明，朱登