PDX模型的建立、分析和应用

人源肿瘤异种移植(PDX)模型的建立、分析和应用FeiZhou肿瘤研究模型•多样化的肿瘤研究模型–病人肿瘤组织/原代肿瘤细胞–永生化的肿瘤细胞系•2D和3D的细胞生物学实验方法（增殖/存活）•来源于肿瘤细胞系的移植模型–来源于病人肿瘤组织的移植(PDX)模型PatientDerivedTumorXenograft1新传统模型：肿瘤细胞系•可以很方便的在体外进行培养和实验•缺点：–在培养和传代过程中进行“筛选”，肿瘤细胞逐渐适应体外培养环境而失去原有特性–缺乏肿瘤相关的生长环境•支持性的非肿瘤基质•血液细胞，免疫系统的交互•其他肿瘤微环境因子2肿瘤研究模型•使用传统的肿瘤研究模型没能取得临床上的成功！–肿瘤的多样化和异质性–研究模型与临床病人缺乏相关性34PDX模型技术流程图ModifiedFigfromOncodesignBiotechnology为什么使用PDX模型？•优势–没有体外培养的过程对肿瘤进行“筛选”–能搞保持肿瘤原有特性和异质性–在传代过程中能够保持分子生物学水平的稳定–保留了原有的非肿瘤基质和微环境–可以对多种状态下病人来源的肿瘤进行研究5PDX模型和肿瘤病人有更好的对应性！使用PDX模型•劣势–仍然不能模拟肿瘤与免疫系统的交互•可以在NSG小鼠模型中部分重建人源免疫系统–在传代过程中模型的非肿瘤基质会被鼠源的基质逐渐取代•使用较低代数的PDX模型进行研究–需要相对便捷的临床肿瘤样本来源–技术水平上有挑战性•移植+分析（包括生物信息学平台）–建立和维持的成本较高•相对的建成之后的使用价值也非常高6•PDX模型的建立•PDX模型的分析•PDX模型的应用7PDX模型的建立•关键点–肿瘤宿主–肿瘤接种–肿瘤的冻存和复苏8宿主品系9小鼠品系免疫缺陷NudeT淋巴细胞严重缺失SCIDSevereCombinedImmunodeficiencyT淋巴细胞和B淋巴细胞缺失NOD-SCIDNon-obeseDiabeticSCID与普通SCID相比NK细胞活性低，更低的免疫恢复几率NSGNOD-SCID-IL2Rγ-/-缺失T淋巴细胞，B淋巴细胞和NK细胞宿主品系•目前并没有针对不同品系宿主的完整比较–移植瘤生长时间–接种成功率–移植瘤遗传学特性–移植瘤组织学特性–移植瘤传代的稳定性•模型建立情况与肿瘤类型相关•荷瘤小鼠的饲养•设施要求（常规为SPF级IVC饲养）•完善的IACUC政策10肿瘤接种•皮下接种11NormanE.SharplessandRonaldA.DePinho,etal.NatureReviewDrugDiscovery2006肿瘤接种•使用套针(Trochar)进行皮下肿瘤接种12XiaomeiZhang,etal.CurrentProtocolsinMouseBiology2013肿瘤接种•原位接种–常用途径：肾包膜下接种(Sub-RenalCapsule,SRC)13PeterEirew,etal.NatureProtocols2010肿瘤组织的冻存和复苏•冻存液–胎牛血清+10%DMSO•保存条件–-80oC：6周–液氮：长期保存•从冻存条件下复苏–37oC水浴快速解冻14肿瘤组织的冻存和复苏•通过冻存和复苏可以：–在获得患者知情同意书之前保存样本–保有备份样本进行重复实验15•PDX模型的建立•PDX模型的分析•PDX模型的应用16PDX模型的分析•目的•说明移植瘤与原瘤的相似性•确认移植瘤在传代过程中的生物学稳定•为PDX模型的应用提供数据支撑17需要保存的材料•基因组DNA–使用代表性的肿瘤组织区域进行DNA提取–如：排除坏死区域等–冷冻保存•总RNA–避免RNA酶污染，一般用试剂盒小心提取，冷冻保存–包含mRNA和miRNA•蛋白样本（组织裂解液）–处理时包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂–冷冻保存18生物样本库分析内容–常规•临床背景–患者年龄/性别；–肿瘤类别，原位瘤/转移瘤；–治疗史•移植瘤分析–生长曲线；–药理学特性•针对特定药物处理的反应•组织学和分子生物学分析–原瘤vs.移植瘤19分析内容–组织学•病理学染色（HE染色）–确认肿瘤组织结构20头颈癌PDX模型维持了原瘤的组织学特性Pengetal.JournalofTranslationalMedicine2013分析内容–组织学•免疫组织化学染色（IHC）–常规标记（如细胞增殖、凋亡）–移植的生物标记物（Her2,EGFR,KRAS等蛋白）–研究者感兴趣的蛋白21DongLin,etal.CancerRes2013神经内分泌前列腺癌PDX模型维持了原瘤的蛋白标记分析内容–组织学•组织芯片(TissueMicro-Array,TMA)22GuidoSauter,etal.NatureReviewDrugDiscovery2003分析内容–分子水平•DNA–基因序列•第二代测序平台：IlluminaHiSeq等–基因突变•SequenomOncoCarta™PanelsV1-3–V1：涵盖19个常规癌基因的238个突变位点–V2：涵盖18个癌基因或癌抑制基因的152个突变位点–V3:：涵盖22个癌基因的105个突变位点–整理过的基因突变数据23分析内容–分子水平•外显子组测序–外显子捕获•RocheSeqCapEZ•AgilentSureSelect•IlluminaTruSeq–使用第二代测序平台进行外显子组测序–需要有整合的生物信息学分析平台•针对PDX模型对二代测序结果分析进行优化•对识别变体的方法进行优化和验证•根据需要开发个性化的数据分析方法24分析内容–分子水平•外显子组测序25右图为Oncotest公司使用外显子组测序结合生物信息学分析方法整理出的23个PDX模型中507个癌症相关基因的突变频率。每一个扇区代表了一种肿瘤类型；热度图指示了该肿瘤类型中某个基因的突变频率。Krzywinsky,M.etal.Circos:anInformationAestheticforComparativeGenomics,GenomeRes(2009)19:1639-1645分析内容–分子水平•RNA–基因表达谱•AffymetrixHG-U133plus2.0Array–单核苷酸多态性(SNP)和拷贝数变异分析•AffymetrixGenome-WideHumanSNPArrayV6.0–miRNA表达数据•miRNAarray26分析内容–分子水平•蛋白表达（蛋白标记）–蛋白免疫印迹WesternBlot–免疫组织化学染色IHC–荧光原位杂交(FISH)27肝癌PDX模型的蛋白表达分析。HungHuynh,etal.CancerRes2006•PDX模型的建立•PDX模型的分析•PDX模型的应用28•新药开发和筛选–研究PDX模型对于药物处理的反应•分子标记物开发(Biomarker)–药物反应分子生物学机制•个性化治疗–分子生物学机制针对性的治疗方案29PDX模型的应用PDX模型的应用30建立PDX模型进行生物标记物的开发来实验个性化治疗Tentler,J.J.etal.Nat.Rev.Clin.Oncol.(2012)PDX模型的应用•分子标记物(Biomarker)的开发流程31TrainingSet•评估药物反应•分析分子生物学特性•生物信息学/统计学分型Development•确认方法适用性•校准标记物表达水平•确认检测方法相关参数和阈值Preclinical•根据生物标记物设计相关的临床实验•使用非临床实验进行预试Validation•在PDX模型上测试生物标记物•在临床实验中确认药物作用PDX模型的应用32Tentler,J.J.etal.Nat.Rev.Clin.Oncol.(2012)33谢谢！