作物育种学总论 第十四章 分子标记辅助选择育种

第十四章分子标记与作物育种绪分子标记辅助选择(MAS)的主要进展1.基因聚合(genepyramiding)2.基因转移(genetransfer)3.数量性状的MAS第一节.分子标记的类型和作用原理遗传标记（geneticmarker）:指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记的类型形态学标记（morphologicalmarker）细胞学标记(cytologicalmarker)生化标记(biochemicalmarker)分子标记(molecularmarker)：DNA分子遗传标记，或DNA标记。即植物的外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点：形态标记简单直观、经济方便；缺点:(1)数量在多数植物中是很有限的;(2)且多态性较差，表现易受环境影响，(3)有一些标记与不良性状连锁。(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。因此形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的。形态标记即植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少。细胞学标记主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是：指结构不同、功能相似的酶，也即具有同一底物专一性的不同分子形式的酶。属于一个以上基因座位编码的酶的不同形式；而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。生化标记•与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。一、分子标记标记的类型和特点目前的分子标记类型第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括RFLP、DNA指纹技术（DNAFingerprinting）等；第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、简单序列重复标记SSR、序标位STS、序列特征化扩增区域SCAR等；第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等。分子标记的特点：（1）直接以DNA的形式表现，表现稳定（2）数量多（3）多态性高（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。（6）成本不太高二、分子标记的原理和遗传特性(一)RFLP标记1.RFLP标记的原理植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态性。基本步骤用DNA限制性内切酶消化Southern杂交放射性自显影或酶学检测DNA提取凝胶电泳分离，转移到滤膜上2）特点A无表型效应，RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。BRFLP标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。C在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰DRFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限制EDNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。PCR-basedmarkersPCR:polymerasechainreaction（多聚酶链式反应）amplificationoftractsofDNAdefinedbybordersequencesthathybridizetoselectedDNApolymeraseprimersRequires:-targetDNA-thermostableDNApolymerase(Taq)-oligonucleotideprimer(s)(7-30nt)-dNTPs+Mg++（二）RAPD标记1.RAPD标记原理RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。（三）AFLP•1.原理2.AFLP标记的主要特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。但也存在假阳性带出现频繁、技术复杂、成本高等缺点。（四）SSR•1.原理•SSR标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。英文缩写英文名称中文名称RFLPRestrictionfragmentIengthpolymorphism限制性片段长度多态性STSSequencetaggedsite序列标签位点RAPDRandomamplifiedpolymor-PhicDNA随机扩增多态性DNAAFLPAmplifiedfrangmentlengthPolymorphism扩增片断长度多态性SSRSimplesequencerepeat简单序列重复SNPSimplemucleotidepolymor-phism单核苷酸多态性几种主要的ＤＮＡ分子标记分子标记的遗传基础标记辅助选择的主要方面是对目标基因的选择，有人称之为前景选择（foregroundselection）。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才能够达到较高的正确率。供体受体RRRrrr(1-r)22r(1-r)r2MRmrMRmr目标基因与DNA标记间的遗传距离位p亲本中DNA标记的带型F1杂种中DNA标记的带型在F2分离群体中分子标记类型即MM,Mm,mmMM类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率利用MAS的遗传基础（以RFLP为例）M—抗性标记R—抗性基因m—感病标记r—感病基因选择的正确率随重组率的增加而迅速下降。重组值越小，其错选率越低。如果要求至少选到一株目标基因型的概率为P，则必须选择具有标记基因型MM的植株至少为：n＝log（1-P）/log（1-p）式中p＝（1－r）2对基因组中其他部分（即遗传背景）选择，称为背景选择（backgroundselections）。背景选择的对象几乎包括了整个基因组，因此，这里牵涉到一个全基因组选择的问题，在分离群体中，由于在上一代形成配子时同源染色体之间会发生交换，因此每条染色体都可能是由双亲染色体重新组装的杂合体。分子标记的优越性1.克服性状表现型鉴定的困难2.允许早期选择3.控制单一性状的多个（等位）基因的利用4.允许同时选择多个性状5.可进行性状非破坏性评价和选择6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提高育种效率三.分子标记辅助选择应具备的主要条件A：与目标基因紧密连锁的分子标记B:简便快捷的标记检测方法Howtouseageneticmarkerformarker-assistedselectionWeaverCarrierSire+WW+++M1M2M1M2M3M3W=Weaver+=Normal目标基因的标记筛选（genetagging）是进行分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。用于MAS育种的分子标记须具备三个条件：①分子标记与目标基因紧密连锁②标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体。③不同遗传背景选择有效。第二节重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术一、遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记遗传作图的原理其原理是基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组，用重组率来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上的位置，并不反映DNA的实际长度。构建遗传图谱的主要环节：①根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体。②对群体中不同植株的标记进行基因性分析。③借助计算机程序构建连锁群构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。用于分子标记的遗传作图可分为两类：a)暂时性分离群体，包括F2群体、BC等b)永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等自花授粉作物作图群体的构建方法P1×P2F1F2F3F4F1B1:BC1F1×P1F1×P1F1×P1B2:BC2DHL异花授粉作物作图群体的构建方法ABCDEfGAbcdEfg×AbCDEfGaBCdefg杂合F1对B、D、G位点来说，相当于F2对A、C、E位点来说，相当于测交F位点不分离F2BC1DHRIL群体形成F1自交后代F1回交后代F1花粉分化个体F2个体自交后代性状研究对象个体个体品系品系准确度低低高高必要的群体规模大大中中分离比例1:2:3或3:11:11:11:1不同作物群体的特点二、近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记http:linkage.rockefeller.edu/soft/list/htmlP×××F1BC1F1BCnFnNIL三、群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记R/Rr/rRrP:F2:F1:Rr抗感杂杂杂感杂抗感杂抗杂杂抗感分离群体分子标记辅助选择抗性鉴定结果四、数量性状基因的定位四.影响分子标记辅助选择(MAS)的因素大量理论和实践研究表明，影响MAS选择效率的因素非常复杂，其中标记与基因(QTL)之间的距离、目标性状的遗传率、群体大小和性质、选用分子标记数目以及标记与基因(QTL)的连锁相等是重要因子。1标记与连锁基因(QTL)间的连锁程度前景选择的准确性主要取决于标记与目标基因的连锁强度，标记与基因连锁得愈紧密，依据标记进行选择的可靠性就愈高。此外，重组值r也影响到由该标记位点等位基因分离产生遗传方差的大小r值越小，遗传方差越大，数量性状的选择效率越高。2性状的遗传率性状的遗传率极大地影响MAS选择效率。遗传率较高的性状，根据表型就可较有把握地对其实施选择，此时分子标记提供信息量较少，MAS效率随性状遗传率增加而显著降低。利用MAS技术所选性状的遗传率应在中度(0.3～0.4)会更好。3群体大小和性质群体大小是制约MAS选择效率的重要因素之一。一般情况下，MAS群体大小不应小于200个。选择效率随着群体增加而加大，特别是在低世代，群体连锁不平衡性越大，MAS效率就越高。由两个自交系杂交产生的F2群体，其连锁不平衡性往往最大，因而其MAS效率也较高。4选用分子标记数目和类型理论上标记数越多，从中筛选出对目标性状有显著效应的标机会就越大，因而应有利于MAS。计算机模拟研究表明当每条染色体上标记数增加到6个以上时效率降低，最优距离为20cM。沈新莲等用2个RAPD标记和1个SSR标记进行棉花纤维强度QTL辅助选择，比较显性标记和共显性标记之间纯