研究生分子免疫学技术-1

细胞因子及免疫细胞功能检测方法简介刘素侠山东大学医学院免疫学研究所2011-2-23内容细胞因子检测的常用方法免疫细胞功能的常用检测方法一、免疫学检测的基本原理•抗原与抗体反应的特异性是各种免疫学检测技术的基本原理二、细胞因子检测方法•细胞因子的临床意义•常规测定法•胞内细胞因子检测方法•细胞因子检测的主要临床应用（一）细胞因子的临床意义•细胞因子与疾病：正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体的严格调控，在病理状态下细胞因子会出现异常性表达，表现为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因子受体的水平增加等。•细胞因子与治疗：重组细胞因子做为生物应答调节剂。已批准生产：IFN-α、β、γ，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在进行临床试验的：IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-β等（二）常规检测方法•分子生物学测定法•生物活性检测法•免疫化学测定法1.分子生物学测定法•是测定细胞因子mRNA的表达水平，主要有两种方法：•分子杂交技术•多聚酶链反应技术（PCR）分子杂交技术•制备细胞因子的基因探针；•Northern杂交或细胞原位杂交；•优点：高度敏感和高度特异；•缺点：操作较繁琐测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。多聚酶链反应技术（PCR）•PCR（polymerasechainreaction)技术，是一种高效的基因体外扩增技术；•将细胞因子产生细胞的RNA提取出来，再经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行PCR扩增；•优点：灵敏度高操作简便•缺点：测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。PCR原理•PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。•由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：dsDNAssDNA②退火(复性)：模板DNA与引物的互补配对③延伸：DNA模板与引物按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新DNA链•新链又可成为下次循环的模板,可将待扩目的基因扩增放大几百万倍5’3’5’3’变性退火延伸第二循环dsDNAssDNA加入引物5’3’3’5’dNTP,Taq酶5’3’5’5’3’3’3’5’5’3’5’5’反转录PCR（ReversetranscriptionPCR，RT-PCR)RTPCRRT-PCR反应过程反转录PCR：mRNA---cDNA---PCR•抽提RNA•反转录合成cDNA•PCR扩增RT反应体系•模板：总RNA，mRNA•引物：随机引物，Oligo(dT)，基因特异性引物（GSP)•逆转录酶：AMVM-MLVQuantReverseTranscriptasePCR反应体系•模板：逆转录产物cDNA•目的基因特异性引物；•反应混合液：dNTP，Taq聚合酶，Mg++RT-PCR反应产物检测•凝胶电泳分析：初步判断产物的特异性。•酶切分析：对扩增产物进行鉴定、对靶基因分型及进行变异性研究。•分子杂交：检测产物特异性，分析碱基突变•核酸序列分析（测序）：是检测PCR产物特异性的最可靠方法实时荧光定量PCR(FluorescenceQuantifiedrealtimePCR)•与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。（1）原理•实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1)常用名词概念•扩增曲线•荧光阈值•Ct值扩增曲线设定荧光域值•PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号；•荧光域值的设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold=10´SDcycle3-15•意义：大于荧光背景值和阴性对照荧光最高值，进入指数期的最初阶段；•真正荧光信号：荧光信号大于阈值荧光阈值（threshold）Ct值•Ct值的含义是：扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的域值时所需要的循环次数C代表Cycle（循环数）t代表threshold（荧光域值）Ct值的确定横坐标：PCR循环数纵坐标：荧光信号强度黑线：荧光域值红线：无模板---域值下一直线绿线：样品Ct值=17（第17个循环时，荧光信号强度达到域值）Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线（2）常用标记方法•非特异性荧光标记：SYBRGreenI•特异性荧光标记：TaqManProbe；分子信标SYBRGreenI染料法•SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI染料法原理注意事项•因为SYBRGreenI可以与所有dsDNA结合而激发荧光，因此，如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体，也可以同时被检测，将导致结果不准确；•关键：设计特异性引物！结果判定——融解曲线（3）qPCR结果分析——相对定量解析1）相对定量的必要性必须用内对照基因（管家基因）进行校正2）管家基因筛选•管家基因：维持细胞生命活动代谢所必须的基因，如GAPDH,beta-Actin,18srRNA等；•筛选方法：根据文献提供；通过具体实验。3）分析方法•双标准曲线法•2-△△Ct法（Ct值比较法）1）双标准曲线法•通过标准曲线对对照样品、待测样品目的基因及管家基因进行定量，然后根据公式计算相对值，即为相对表达量。•公式：校正值目的基因定量结果管家基因定量结果相对值待测样品校正值对照样品校正值==校正值=目的基因定量结果校正值=管家基因定量结果目的基因定量结果校正值=对照样品校正值待测样品校正值对照样品校正值=待测样品校正值对照样品校正值相对值=待测样品校正值对照样品校正值优缺点•优点：分析简单，实验优化相对简单；•缺点：对每一个基因，每一轮实验均需要做标准曲线；•应用：基因表达调控研究2）2-△△Ct法•2-△△Ct法：假设目的基因、对照基因扩增效率均是100%△Ct（处理前/对照组）=18-17=1△Ct（处理后/实验组）=16-17.4=-1.4△△Ct=△Ct（处理后）-△Ct（处理前)=-2.4比率（处理后/处理前）=2-△△Ct=2--2.4=5.3•结论：JUN处理后表达水平是处理前的5.3倍•修正：扩增效率不是1，而是E，2-△△Ct可修正为（1+E）-△△Ct优点•特异性好；•简单、安全、自动化程度高；•速度快、高通量；•线性关系好、线性范围宽2.生物活性检测法•测定细胞因子的生物学活性：刺激细胞增殖、维持细胞生长和存活、抑制细胞生长、溶解或杀灭细胞、抗病毒、促进细胞趋化、刺激细胞生成集落等活性；•指示细胞：多选用造血系统或淋巴系统细胞，最好用依赖性细胞株细胞；•显示细胞反应：用3H-胸腺嘧啶核苷参入，或用四唑盐转化引致的颜色反应。（1）依赖性细胞株•一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些依赖细胞株检测相应的细胞因子；•优点：敏感性高，特异性强；•缺点：应用有限。（2）功能检测•利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。•优点：敏感性高；•缺点：特异性不够，容易受一些扰因素的影响。A.增殖或增殖抑制法•其基本原理是应用某一细胞因子能特异地刺激或抑制某些指示细胞的增殖，通过3H-TdR掺入或MTT法显色，反映待检细胞因子的活性水平。B.集落形成法•其基本原理是应用骨髓干细胞体外半固体培养系统，根据不同造血因子能诱导干细胞或定向造血祖细胞形成某一种或某些种类细胞的集落，通过对形成集落形态学、酶学鉴定，计算不同种类集落形成的数量和比例，反映待测标本中CSF的种类和活性水平。C.直接杀伤靶细胞•细胞因子TNF-α、TNF-β具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用，采用TNF敏感的细胞株如小鼠成纤维细胞株L929，以WEHI164亚克隆13（鼠纤维肉瘤细胞系）作为指示细胞，通过3H-TdR释放法或染料染色等可检测待检样品中TNF的活性水平。D.抗病毒效应•靶细胞受某些病毒感染后可发生明显病变和死亡，干扰素可保护靶细胞免受病毒的攻击；•常用的病毒是水疱性口炎病毒（vesicularstomatitisvirus,VSV），敏感的指示细胞为喉癌的上皮细胞株Hep2和羊膜的上皮细胞WISH，通过干扰素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）抑制病毒致病变的程度，计算出待测样品中IFN的活性单位。E.趋化作用•IL-8对多形核细胞、淋巴细胞具有趋化作用，可用小室法或软琼脂趋化法，PMN或淋巴细胞作为指示细胞，以细胞趋化的程度来反映样品中IL-8活性水平。F.抗体形成法•IL-6可在体外刺激某些B淋巴细胞系产生和分泌免疫球蛋白；•指示细胞：分泌IgG的ARH-77、CESS分泌IgM的SKW6.CL-4•方法：在一定条件下，待检样品中IL-6水平与培养细胞上清IgG或IgM水平正相关，通过标准IL-6的对照可推算出待检样品中IL-6的活性。•IL-2的诱生及生物活性测定（试验四）一般方法•细胞因子敏感的细胞株•细胞因子的标准品及待测品•指示剂：MTT，3H-TdR•酶联免疫吸附测定仪测定OD值•绘制标准曲线–标准品50%最大OD值–找出与标准品50%最大OD值相对应的标准品稀释度(S)–找出与标准品50%最大OD值相对应的待测品稀释度(A)•待测品单位数=S/A×标准品单位稀释度OD值1/81/4S1/2A1100%OD50%OD标准品待测品对生物学活性测定法的评价•优点：灵敏度高；测定的是有生物活性的细胞因子•缺点：维持靶细胞株，操作繁杂和难定量特异性差实验周期较长易受其它因素的影响3.免疫化学测定法•用来检测细胞因子蛋白质的抗原特性，利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。•基本原理是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。•免疫标记技术•Radioimmunoassay•Immunofluorescence•酶免疫分析(EIA)：ELISA：体液中的细胞因子免疫组织化学ELISPOT：分泌细胞因子的T细胞（频率）60（三）胞内细胞因子检测方法•测定的是细胞因子的前体分子，是单一细胞行为；•一般要用先活化细胞，使之合成欲测细胞因子。在活化过程中加入蛋白质运输抑制物，如莫能菌素(monensin)和布雷菲尔德菌素A，阻止了细胞因子分泌，提高了胞内检测的阳性率；•检测方法：ELISPOT荧光标记：荧光显微镜或FCM活化剂•活化T细胞：除特异性抗原外，主要植物血凝素(PHA)、巴豆酯(PMA)、离子霉素（ionomycin）、钙离子载体A23187、T细胞受体抗体或CD3的抗体等；•活化B细胞：特异性抗原，脂多糖（LPS）、金黄色葡萄球菌肠内毒素A、B细胞受体抗体；•活化单核细胞：LPS和某些细胞因子。人外周血单个核细胞IL-17A流式检测方法•人外周血单个核细胞（PBMC）的分离；•调整细胞浓度接种24孔板或96孔板；•加入BrefeldinA，PMA和ionomycin（离子霉素），进行细胞培养；•一定时间后，收集细胞进行表面抗原染色（如CD4或CD8）、固定和通透、细胞内细胞因子染色、流式细胞仪测定和结果分析。(1)抗凝静脉血(2)加等量NS(4)密度梯度离心血浆分离液RBCPBMCPMN(3)混匀后，缓慢加于分离液上图1.表达IL-17和IFN-的CD4+T细胞分析图2.CD4+T细胞表达转录因子FoxP3的检测（四