基因敲除专题

基因敲除概述基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用。基因敲除的发展史基因敲除的成就70岁的美国科学家马里奥·卡佩奇（中），82岁的美国科学家奥立佛·史密斯（右）与66岁的英国科学家马丁·埃文斯（左），凭借基因打靶技术共同分享了2007年度诺贝尔生理学或医学奖。因为他们发现了如何用基因控制老鼠胚胎细胞，评委会认为，是因为其“开创了全新的研究领域”，为人类攻克某些疾病提供了药物试验的动物模型。2007诺贝尔生理学医学奖获得者马里奥·卡佩奇曾经流浪街头，童年的坎坷炼成了他日后坚强的性格70岁小故事：卡佩奇曾有着坎坷的传奇经历：童年时正值二战，母亲因为反法西斯的写作而被关入纳粹集中营，他流落成意大利街头的小混混，以乞讨和偷窃为生。母子团聚后，他得以来到美国并接受教育，后来在1967年获得了哈佛大学的生物物理学博士学位，还曾在DNA双螺旋发现者之一詹姆士·沃森（JamesD.Watson）的实验室工作。他的一位朋友描述道，他“意志坚强，不受约束，即使处于逆境，对于好的想法和重大计划的追求总是乐此不疲”。当1980年卡佩奇向美国国立卫生研究院（NIH）申请课题，要在哺乳动物细胞上建立基因靶向技术时，没有通过评审。他得到的建议是忘了这念头。然而卡佩奇坚持他的想法。当时卡佩奇已经证明，可以用同源重组的手段将特定的外源基因导入到酵母细胞基因组中，他觉得，新的遗传物质也应该可以用这种方法引入哺乳动物的基因组。卡佩奇从自己的其他项目中挪出经费来继续这项研究，不久，他就证明了这一点。那么，用一段坏了的基因序列去替代原来那个有功能的基因序列，就能起到让该基因罢工的目的，这就是基因敲除。与此同时，奥利弗·史密西斯也在独立地做类似的工作。奥利弗·史密西斯等人的工作让在培养细胞中的基因靶向技术成为可能82岁小故事：1985年，奥利弗·史密西斯发表了一篇极为重要的论文，报道在红白血病细胞中实现了外来基因和细胞Beta-球蛋白基因间的同源重组，他还提出了将同源重组用于修复突变基因的概念，也就是不将特定的基因敲除，而仅仅对它加以修饰改变。卡佩奇和史密西斯的工作让在培养细胞中的基因靶向技术成为可能。然而，要想对整个动物活体中的基因“动武”，看上去还很困难。那时，在大西洋另一侧，马丁·埃文斯正在英国的剑桥大学开展关于胚胎干细胞的研究。马丁·埃文斯的胚胎干细胞研究对于基因敲除技术具有重要意义66岁小故事：1981年，马丁·埃文斯领导的研究小组从小鼠的胚胎中提取到了胚胎干细胞，将这种细胞经过培养，再植入小鼠囊胚内，小鼠长成后就成为一个嵌合体：有一些细胞是原先胚胎分裂而来的，而另一部分则由植入的胚胎干细胞分化而来。卡佩奇和史密西斯很快意识到了这一技术对于他们工作的意义：用同源重组对胚胎干细胞中的基因加以改造，再将这种细胞植入动物体内，经分化以后，整个动物体内就“嵌合”了这种特别的细胞。若运气好，还能得到基因被改造过的生殖细胞，通过两代繁殖，就能孕育出纯合体的基因修饰小鼠。他俩各自开展工作，1989年，卡佩奇发表了一篇里程碑式的论文，第一只通过胚胎干细胞同源重组获得的基因敲除小鼠出现了。至此，基因靶向技术真正成熟。1989年，卡佩奇发表了一篇里程碑式的论文，第一只通过胚胎干细胞同源重组获得的基因敲除小鼠出现了。2012年诺贝尔生理学或医学奖约翰・格登JohnB.GurdonShinyaYamanaka山中伸弥发现成熟细胞可以被重新编程为多功能的干细胞（即诱导多功能干细胞）他的表现远不能令人满意，他从来不听从教导，经常固执己见，按照自己的想法胡搅蛮惨，因此常常陷入到困境里。我知道他立志将来成为一位科学家，这很不错有理想有目标，不过根据他现在的表现，这非常荒谬。如果他不能学会一些简单的生物学常识，将来根本不会有任何机会去做一位专家级的工作，不管对他自己还是教他的老师们来说，纯粹是浪费时间基因敲除定义实现基因敲除的多种原理和方法基因敲除技术的应用及缺陷基因敲除定义：中文名称：基因敲除英文名称：geneknock-out;geneknockout其他名称：基因剔除定义1：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。广义的基因敲除包括某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。常用同源重组的方法。敲除的基因用以观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。定义2：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的方法。常用同源重组的方法敲除目的基因，观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。定义3：在基因组水平上改变或破坏靶基因的结构，使其功能完全丧失的实验技术。实现基因敲除的多种原理和方法:2.1利用同源重组进行基因敲除2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤2.1.2条件性基因敲除法2.1.3诱导性基因敲除法2.1.4同源重组基因敲除缺点2.2利用随机插入突变进行基因敲除2.2.1基因捕获法2.2.2基因捕获法的优缺点2.3其它基因敲除技术2.1.1基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤a．基因载体的构建：b．ES细胞的获得ｃ．同源重组：ｄ．选择筛选已击中的细胞：ｅ．表型研究：f．得到纯合体：由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠B,BamHI在CH12B细胞系中敲除XRCC1基因的策略PuroXRCC1野生型基因基因敲除质粒同源短臂同源长臂外显子上游引物上游引物流动引物流动引物LoxPLoxPPuroXRCC1敲除后基因型上游引物流动引物LoxPLoxP2.1.2条件性基因敲除法条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法利用Cre／LoxP实现靶基因的切除原理利用Cre／LoxP和来自酵母的FLP—frt系统条件性基因敲除的基因重组及切除步骤2.1.4同源重组基因敲除缺点(1)操作复杂,实验周期长,费用偏高;(2)在敲除过程中,被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区,残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能,这将给表型分析带来麻烦;(3)对于某些必需基因,敲除后会造成细胞死亡,也就无法研究这些必需基因的功能;(4)由于基因功能上的冗余,敲掉一个基因并并不能造成容易识别的表型,基因家族的其他成员可以提供同样的功能;(5)同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除,获得的表型差异很大。总的来说,基因敲除小鼠模型的建立周期长、技术含量高、风险性大。至今国内外仍没有在基因打靶方面取得突破性进展使得此技术能够满足快速化、高通量研究基因功能的要求。2.2利用随机插入突变进行基因敲除原理：此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白2.2.1基因捕获法基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法。基因捕获法的基本原理图2.2.2基因捕获法的优缺点利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。2.3RNAi由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中。近年来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更为简单方便的方法。RNAi阻断基因表达的机理图①、②：双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面双链RNA还能在RdRP（以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RNAdirectedRNApolymerase，RdRP）的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。③：siRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。④：上述复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。⑤：这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。2.3.2RNAi的优缺点contentsCRISPR-Cas9System3.基因敲除技术的应用及缺陷①．建立生物模型。在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。②.疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。③.提供廉价的异种移植器官。众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。如：PPLTherapeutics公司于1999年已成功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了α－1，3GT基因。使每只猪都缺乏产生a１－３半乳糖基转移酶的基因的２个拷贝。这些酶在细胞表面产生一种糖分子，人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性，从而引发超急性免疫排斥反应。在缺乏这种酶的情况下，超急性排斥反应即不会再发生。④.免疫学中的应用。同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。⑤改造生物、培育新的生物品种。细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。基因敲除技术的缺陷CRISPR/Cas9TargetedgenomeeditingAndmanyothers“Genomeeditinghasneverbeeneasier”CRISPR/Cas系统•CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。•CRISPR/Cas系统是细菌针对噬菌体等外源基因的获得性免疫系统。CRISPR——Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(规律成簇的间隔短回文重复)。CRISPR/Cas——CRISPR-associated。Cas（CRISPRassociated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。CRISPR/Cas系统分类CRISPR位点通常由短的高度保守的不连续的同向重复和及其间隔着的大小与之相近的非重