氢盐水对卒中后抑郁小鼠的治疗作用和机制研究

第二军医大学博士学位论文氢盐水对卒中后抑郁小鼠的治疗作用和机制研究姓名：王施申请学位级别：博士专业：神经内科指导教师：丁素菊2011-04氢盐水对卒中后抑郁小鼠的治疗作用和机制研究摘要背景卒中后抑郁(post-strokedepression,PSD)是卒中最常见的并发症之一,发病率为30%-50%。PSD属于神经和精神系统的学科交叉地带，对其认识不足,危害性被忽视和低估。PSD的病因目前尚不十分清楚。近年研究认为脑缺血引起的神经元损伤可能并非PSD的病因，而髓鞘损伤与抑郁的关系越来越受重视。Rajkowska等提出，情绪障碍的病理特点是胶质病变。组织病理学结果显示重性抑郁障碍、躁狂发作的患者前额叶脑区神经胶质细胞数量或密度降低。传统观点认为脑缺血后最易导致神经元损伤，近年研究表明少突胶质细胞缺血耐受性并不比神经元好，甚至短暂性脑缺血即可引起少突胶质细胞的损伤。少突胶质细胞的损伤与缺氧引起的氧化应激、兴奋性毒性等有关。氢是自然界的基本元素，氢气是无色、无味，而且具有一定还原性的双原子气体。呼吸一定浓度的氢可治疗脑缺血再灌注损伤。2007年7月，日本医科大学Ohsawa在《自然医学》报道，动物呼吸2%的氢气就可有效清除自由基，显著改善脑缺血再灌注损伤。此后国内外多个试验证实注射饱和氢气盐水对新生小鼠脑缺血缺氧损伤，对心肌、肾、小肠缺血再灌注损伤均有明显的治疗作用。目前认为，氢气治疗缺血再灌注损伤的基础是选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子，从而起到抗氧化作用。目的本课题首次将氢盐水用于缺血再灌卒中后抑郁小鼠模型。探讨氢盐水对以胶质损伤为重要背景的卒中后抑郁有无治疗作用；氢盐水对胶质损伤有无保护作用及其可能的机制。胶质损伤的修复在卒中后抑郁改善过程中是否起到作用，氢盐水对这一过程有无影响。第一部分卒中后抑郁小鼠模型的建立方法：我们采用实验室常用的双侧颈总动脉完全阻断1小时后再灌注，结合行为应激1周的方法造模。结果：缺血再灌注组悬尾静止不动时间在术后第3天即高于假手术组，强迫游泳静止不动时间在术后第7天即高于假手术组，并呈时间依赖性递增。至第14天悬尾静止不动-1-第二军医大学博士学位论文时间135.4±27.8秒，高于假手术组63.6±13.9秒，有统计学意义（P0.001）。缺血再灌注组强迫游泳静止不动时间在术后第7天即高于假手术组，并呈时间依赖性递增，至第14天强迫游泳静止不动时间86.6±13.7秒，高于假手术组64.2±9.6秒，有统计学意义（P0.05）。病理学也提示：术后14天，缺血再灌注组Nissl染色10倍物镜下海马Hilus区细胞数为32±2.5个；少于假手术组的49±3.2个，有统计学意义（P0.001）。结论：本模型稳定，重复性好。第二部分氢盐水对缺血再灌卒中后抑郁小鼠的治疗作用方法1、动物分组：①假手术组（不阻断血流，其余同对照组）②氢盐水干预3天组(8ml/kg,i.p.，1/日)③氢盐水干预7天组④氢盐水干预14天组⑤生理盐水对照组（将干预改为生理盐水）。每组共32只，总数160只。在术后第7、14、21、28天4个时间点测行为学指标及取血液、脑组织标本，每次每组8只。2、行为学检测：悬尾实验、强迫游泳实验均持续6分钟，记后4分钟内静止不动时间；定位航行实验测量90秒时程内上台潜伏期、目标象限活动时间百分比；自发活动实验测量3分钟时程内小鼠在畅箱中休息时间及活动路程。3、病理学：常规HE染色，尼氏染色并计数海马Hilus区细胞。结果氢盐水各组对改善缺血再灌卒中后抑郁小鼠悬尾静止不动时间有明确的作用。对于术后的定位航行实验上台潜伏期的缩短和自发活动中休息时间的缩短均有作用。其趋势也较生理盐水组明显。而对于强迫游泳静止不动时间，氢盐水干预组与生理盐水对照组相比无组间差别。对于自发活动总路程和中央路程也无明显改变。氢水14天组的Hilus区的术后21天神经元细胞数量为42.5±3.1个，比生理盐水对照组32.5±3.1个多，有统计学意义（F=25.548，P=0.001）。其他两个氢盐水组与对照组无差别。证实氢水干预14天具有神经保护作用。从另一方面也反证了卒中后抑郁的产生与卒中之后的环境应激有关，具有一定的时间依赖性。可能稍长时间的神经保护措施仍是必要的。结论1、氢盐水各组可改善缺血再灌卒中后抑郁小鼠的行为学指标。-2-氢盐水对卒中后抑郁小鼠的治疗作用和机制研究2、病理证实氢盐水干预14天具有神经保护作用。第三部分氢盐水对缺血再灌卒中后抑郁小鼠的治疗作用机制探讨方法：1、脑组织自由基含量检测：购买南京建成公司试剂盒测羟自由基及氧化应激反应下游产物丙二醛。2、免疫组化荧光染色:少突胶质前体细胞标志物NG2及髓鞘碱性蛋白MBP染色3、统计分析各处理组前额叶皮层下术后第7天NG2阳性细胞数以及第21天MBP的荧光Density/Area。4、将NG2阳性细胞数和MBP荧光Density/Area分别与悬尾静止不动时间作相关分析。结果：1、氢盐水各处理组可有效清除羟自由基（F=57.510，P0.001）以及减少丙二醛生成（F=8.722，P0.001）。2、氢盐水14组第21天MBP免疫荧光Density/Area高于对照组（P0.001），并与悬尾不动时间负相关（PearsonCorrelation：-0.646）。也就是氢水14天组的髓鞘形态与功能得到一定程度的修复。结论：综合以上三部分结果，我们得出以下结论：1、氢盐水对于改善卒中后抑郁小鼠抑郁行为有作用。2、小鼠全脑缺血再灌注后，氢盐水具有抑制羟自由基能力和清除丙二醛的作用。3、小鼠全脑缺血再灌注后，连续腹腔注射氢盐水14天，海马Hilus区的术后21天神经元细胞数量为42.5±3.1个，比生理盐水对照组32.5±3.1个多，有统计学意义（F=25.548，P=0.001）。证实氢水14天组具有神经保护作用。4、氢水干预缺血再灌注14天后，第21天MBP免疫荧光Density/Area高于对照组，并与反映行为绝望的悬尾静止不动时间呈负相关。说明该组小鼠髓鞘形态与功能的修复较对照组明显。有可能氢盐水干预缺血再灌注后小鼠，促进了额叶少突胶质细胞向髓鞘的分化。-3-第二军医大学博士学位论文[关键词]：氢盐水，卒中后抑郁，全脑缺血再灌注，活性氧自由基，氧化应激，少突胶质细胞，髓鞘，髓鞘碱性蛋白-4-氢盐水对卒中后抑郁小鼠的治疗作用和机制研究AbstractBackgroundPost-strokedepression(PSD)isoneofthemostcommoncomplicationofstrokeandtheincidencerateisabout30%-50%.ThefieldofPSDareinterdisciplinaryareasbetweenneurologicalandpsychiatricwhilethedangerofithasbeenneglectedandunderestimatedforlackofknowledge.TheetiologyofPSDhavebeenunclearyet.RecentstudiessuggestthatneuronaldamageinducedbycerebralischemiamaynotbethemajorcauseofPSDwhilecorrelationbetweenmyelinlesionanddepressionareincreasinglyconcernedabout.Rajkowskaputforwardthatthespecificpathologicalcharactersofmooddisordersisgliallesions.Histopathologyshowedthatpatientswithmajordepressivedisorder,manicepisodehavedecreasedglialcellnumberordensityinprefrontalbrainregions.Thetraditionalopinionthatneuronalleasionsaremostvulnerabletoinvolvedbycerebralischemiawhilerecentstudieshaveshownthatoligodendrocytesischemictoleranceisnotbetterthanneurons.Eventransientischemicattackcanleadtoinjuryofoligodendrocytes.Oligodendrocyteinjuryareassociatedwithoxidativestress,excitotoxicityinducedbyhypoxiaandsoon.Hydrogenisthebasicelementofnature,hydrogeniscolorless,odorlessdiatomicgasesandhasacertainreduction.Acertainconcentrationofhydrogenbreathcouldcurecerebralischemiaandreperfusioninjury.July2007,theJapanesescholarOhsawareportedthatanimalsbreathing2%hydrogencaneffectivelyeliminatefreeradicals,significantlyimprovedcerebralischemiaandreperfusioninjury.Nextseveraldomesticandinternationaltestsconfirmedthathydrogensaturatedsalineinjectioninneonatalhypoxicischemicbraininjuryofmyocardium,kidney,smallintestineischemiaandreperfusioninjuryhavesignificanttherapeuticeffect.Thepresentviewofhydrogentreatmentinischemia-reperfusioninjuryisbasedontheselectivityeffectsofthenitriteanionandhydroxylradicalsandthusplayaroleinanti-oxidation.ObjectivesWeapplicatedhydrogensalineinPSDmodelinmiceforthefirsttime.ResearchwhetherhydrogensalinehadatreatmenteffectstoPSDmicewhichhadabackgroundofgliallesions;whetherhydrogensalinehadaprotecteffectsingliallesionswhetherandits-5-第二军医大学博士学位论文possiblemechanism.WhetherglialdamagerepairmentprocessofplayaroleinimprovementofPSDandwhetherhydrogensalinehastheimpactofthisprocess.PartⅠSetupaPost-strokedepressionmodelinmiceMETHODS:Weusedlaboratorycommoncarotidarterycompletelyblockedby1hourafterreperfusion,with1weekofthemethodofstressbehaviormodeling.Results:Tailsuspensionimobilitytimeofischemia-reperfusionwaslongeron