分子生物学常用技术(简化版)

第19章：分子生物学常用技术－－4学时分子杂交、PCR、基因测序蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交)基因转移与基因剔除(含RNA干扰)第20章：基因工程－－4学时第21章：基因诊断与基因治疗－－4学时第四篇：分子生物学技术与应用第十九章分子生物学常用技术分子生物学技术能帮助我们干什么？揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的结构与功能DNA水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位RNA水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能细胞与整体水平：基因在活体中的功能目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段我们需要了解和掌握哪些基本技术？基本技术：核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用综合技术：基因工程技术转基因生物与基因敲除技术应用技术：基因诊断基因治疗Molecularhybridization:利用已知核酸序列(探针/probe)检测与其互补的未知核酸序列用途：确认核酸序列间同源性对特定核酸序列进行定量自核酸混合体中辨认特定核酸序列第一节：核酸分子杂交一、基本原理变性(denature)复性(renature)杂交(hybiridization)核酸变性在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程破坏氢键与疏水作用可导致变性热变性：高温可使核酸变性，温度高于90℃时任何核酸双链都将变性酸碱变性：pH3或pH11时核酸将变性，DNA使用碱变性，RNA则不可化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素或甲酰胺可使核酸变性变性温度Tm：meltingtemperature，解链温度或变性温度影响变性温度的因素：溶液的离子强度变性温度与离子强度正相关，低盐利于变性DNA分子的GC含量GC％＝(Tm－69.3)×2.24核酸复性变性的DNA单链相互识别并结合，恢复其天然双螺旋结构的过程复性类似与化学反应，需要一定反应时间影响DNA复性速度的因素DNA分子的浓度：浓度高，复性快DNA分子的长度：长片段复性速度慢DNA分子的复杂性：重复序列复性速度快不同物种C0t曲线比较人类基因组C0t曲线二、核酸探针Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列探针为DNA或RNA，可以为单链或双链探针必需经过标记：放射性标记或非放射性标记1.探针有哪些种类？DNA探针：常规探针利用基因组DNA序列或cDNA序列合成的探针，一般为双链，也可制备成单链RNA探针：高灵敏度探针一般是通过体外转录而来，均为单链寡核苷酸探针(oligo-nucleotide)：用于点突变检测人工合成的短序列(~20nt)，可自由选择序列2.标记物有哪些？标记物的要求：高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检测到特异的靶序列标记物的种类：放射性同位素(radioisotope)非放射性标记物(non-radioactivelabel)放射性同位素特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微量的核酸序列g→mg→μg→ng→pg→fg常用的放射性同位素放射性标记的核苷酸单体dNTPorNTP5’or3’P32labelling非放射性标记物特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及放射性同位素地高辛：通过地高辛抗体结合并检测生物素：结合亲和素/链亲和素(avidin/streptavidin)化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光电子密度标记物：金等重金属3.如何检测杂交信号？同位素标记物：盖革计数器、液体闪烁计数器放射自显影(autoradiography)如何检测杂交信号？非放射性标记物：酶联免疫技术(enzymelinkedimmuno-assay)化学发光(chemiluminescence)三、如何对核酸探针进行标记？1.缺口平移nicktranslation:适用于标记双链DNA控制DNaseI的用量，可以控制探针的长度2.非放探针的酶促标记生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可以参入探针3.非放探针的化学标记利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合四、如何进行杂交？样品(DNAorRNA)吸附于支持物尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等与标记的探针杂交封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行缓冲液清洗控制温度与变性剂浓度显色放射自显影/酶联显色五、杂交有哪些不同的方式？斑点杂交：dothybridizationSouthern印迹杂交：SouthernblotNorthern印迹杂交：NorthernblotWesternblotting：不是杂交原位杂交：insituhybridization反Northern印迹杂交：reverseNorthernblot基因芯片/DNA微阵列：Genechip/DNAmicroarraydothybridization将核酸样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交特点：简便但特异性不高可探测核酸含量，但无法得知分子大小SouthernblotEdwinSouthern创立的方法电泳技术与杂交结合，可显示靶DNA序列的长度可进行毛吸管转移、真空转移与电转移电泳转膜杂交Northernblot类似于Southern印迹杂交的方法，用于RNA检测insituhybridization原位杂交：特定mRNA的组织细胞分布FISHFluorescenceinsituhybridization(FISH)：特定基因的染色体定位反Northern杂交与DNA芯片反Northern杂交：将探针DNA片段固定在杂交膜上，利用标记物标记的RNA进行杂交第二节：聚合酶链式反应PCR，polymerasechainreaction在体外选择性扩增特定DNA片段的高效手段70年代有人提出PCR的设想，因缺乏寡核苷酸的合成手段和适合的酶而无法进行1984年KaryMullis发明PCR，并因此获得1993年的诺贝尔化学奖全自动的热循环仪和多种PCR衍生技术使其成为重要的科学研究手段一、PCR的基本原理在体外，以特定引物引导，通过DNA聚合酶选择性扩增特定区域变性(denature)退火(anneal)延伸(extension)DNA的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNA解旋解链引物合成DNA的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解旋解链引物合成新链延伸DNA的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’变性复性加热退火DNA加热解链模板DNA94℃55℃引物1引物2DNA引物引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第1轮结束94℃第2轮开始72℃TaqTaqTaqTaq55℃第2轮结束重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性新链延伸DNA的体外扩增热循环DNA解链PCR反应体系4种dNTP混合物各200µmol/L引物各0.1-0.5µmol/L模板DNA0.1～2µgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+1.5mmol/LDNA的体外扩增PCR技术的特点高度的灵敏性：理论上经20循环可将目的基因片段扩增220＝1000000倍高度的特异性：利用引物与模板的特异性配对，可保证扩增的特异性一对20碱基长引物的多样性为440＝1024应用的广泛性：目前已经成为分子生物学研究必不可少的手段操作的简便性：不需要复杂的设备和繁琐的流程二、做PCR要有什么条件？酶：TaqDNA聚合酶模板DNA：可以为基因组DNA或cDNA引物：人工合成的寡核苷酸片段dNTP：聚合反应的核苷酸单体缓冲液：包含特定的pH、离子强度和Mg2+反应程序：变性、退火、延伸组成的循环仪器：DNA热循环仪，或称PCR仪DNA聚合酶催化的聚合反应dNTP1.什么是耐热DNA聚合酶早期PCR曾使用DNA聚合酶I在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶延伸反应温度为37℃，非特异性太多目前常用TaqDNA聚合酶纯化自嗜热水生菌(Thermusaquaticus)可耐受95℃高温，最适反应温度为72℃左右TaqDNApolymerase在70~75℃范围活性最佳，每秒可延伸150nt95℃时的半衰期为40min按变性时间1min计，能满足30循环的反应Taq酶具有5’→3’聚合活性和5’→3’外切活性不具备校读活性，错误率为2×10－4左右错误合成的DNA片段可以作为模板，循环数越多，最终扩增产物错误率越高只能用于检测，不适合基因克隆有保真性的耐热DNA聚合酶吗？PfuDNApolymerase：常用的高保真耐热DNA聚合酶有5’→3’外切活性错误率约1×10－6适应于基因克隆2.如何设计寡聚核苷酸引物？引物(primer)是PCR反应必备的前提，对PCR产物类型、长度和反应的特异性具有决定作用PCR需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段长度引物设计原则引物长度一般为15~30核苷酸引物太短影响杂交体的稳定和特异性引物太长随机匹配序列增多，特异性反而下降GC含量一般为40％~60％应充分考虑退火温度(annealingtemperature)GC含量低，退火温度低，易出现非特异GC含量高，非特异性结合也会增加引物解链温度粗略计算公式：引物的解链温度Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T)引物设计原则引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现发卡结构两条引物间、同一引物的分子间不应存在互补序列出现互补易导致引物二聚体的出现，影响扩增效率引物设计原则避免引物与非特异序列间的同源性引物的3，末端必须与模板完全互补，5，末端允许添加非配对序列5，末端允许添加非匹配序列，如：酶切位点5’3’3.如何选择dNTP和缓冲液?dNTP是聚合反应的底物常规使用浓度：0.2mMeach探针标记时，可使用同位素或非放标记的dNTP缓冲液：特定的pH和离子强度Mg2＋浓度一般为1.5mMPCRmix：预制的便捷反应体系4.用什么做模板DNA？PCR的模板(template)可以是基因组DNA或cDNA逆转录-PCR(reversetranscriptionPCR)：RT-PCR在利用DNA为模板进行扩增时纯化比较简单血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本经简单处理后均可直接进行PCR扩增RNA样品一般要经过严格纯化，并逆转录未经纯化的RNA不稳定，无法进行逆转录反应体系中如存在DNA，将对RNA扩增产生干扰6.如何设计反应程序？PCR的循环数：理论上20~25即可满足扩增需要，但实际循环数一般为25~35过多循环后到达平台期，继续延长循环数无效模板浓度高时平台期出现早，模板浓度低时平台期出现晚，应根据模板浓度调节循环数反