第十章 植物种质资源的保存

第十章植物种质资源的保存一、概念及保存类型植物种质资源保存是指利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源，使个体中所包含的遗传物质保持其遗传完整性和活力，并能通过繁殖将其遗传特性传递下去。保存类型有两种，即原生境保存和非原生境保存。1、原生境保存将植物的遗传材料保存在它们的自然环境中。原生境保存的地方多是植物保护区，另一种方法为农田种植保存。珍宝岛国家级自然保护区美国、马里兰、农田2、非原生境保存将植物的遗传材料保存在不是它们的自然生境的地方。非原生境保存方式有植物园、种子库、种质圃、试管苗库、超低温库等。具体保存方法有四种：种植保存、贮藏保存、离体保存和基因文库保存。华南植物园超低温库二、种质资源离体保存离体保存方法：◆低温保存◆超低温保存◆生长抑制剂保存（一）低温保存一种缓慢生长保存方法，是通过控制培养温度来限制培养物各种生长因子的作用，使培养物生长减少到最低限度。低温保存的基本特征是保存材料的定期继代培养，不断繁殖更新；基本措施是控制保存材料所处的温度和光照。延缓保存材料生长速度的另一项措施是改变培养基的成分。种质库要定期检查，保持清洁，及时清除污染材料，并注意积累资料。（二）超低温保存即冷冻保存，一般以液N2为冷源，使保存温度维持在-196℃。1、保存原理低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。植物材料在超低温条件下，冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分次生结冰而达到植物材料保存目的。植物细胞含水量大，冰冻保存难度大，投放液N2中易引起组织和细胞死亡，故须借助于冷冻防护剂，防止细胞冰冻或解冻时引起过度脱水而遭到破坏，保护细胞。超低温冰箱2、基本程序超低温保存的基本程序包括预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻和再培养。（1）预处理为保证茎尖在液N2处理后具有稳定且高的存活率，需进行一定的预处理，或在冷冻防护剂存在下进行预培养，或直接进行低温（-3—10℃）预处理。（2）冷冻处理冷冻处理的方法有快速冷冻法、慢速冷冻法、预冷冻法和干燥冷冻法。a、快速冷冻法指将植物材料从0℃或者其他预处理温度直接投入液氮中保存的方法，降温速度为1000℃/min。要求细胞体积小、细胞质浓厚、含水量低、液泡化程度低的材料。b、慢速冷冻法将处于0℃或其他预处理温度的材料以1—2℃/min的降温速度从起始温度降到-100℃，稳定1h后，投入到液氮保存或以此降温速度连续降温至-196℃的方法。适宜保存的材料有成熟的、含有大液泡和含水量高的细胞，对于保存在悬浮培养中的细胞特别有效。c、预冷冻法指将植物保存材料放入液氮前，需经过短暂时间的低温锻炼的方法。可分为两步冷冻法和逐级冷冻法。可使保存材料细胞内充分脱水，避免因细胞内结冰而导致不可逆伤害的出现。d、干燥冷冻法将材料置于27—29℃烘箱内降低植物含水量，再投入液氮中保存的方法。可防止材料冻死。（3）冷冻贮存适宜温度下贮存冷冻材料也很重要。长期内贮存在液氮内的材料，需合适的液氮容器。冷冻贮存的茎尖随保存时间的延长，其生活力可能下降。（4）解冻植物材料在超低温贮存过程中所发生的冻害是在冷冻和解冻过程中产生的。解冻过程中发生的冻害是由细胞内次生结冰造成的。解冻过程中水的渗透冲击对细胞膜体系造成破坏。a、快速解冻法是指将液氮中保存的材料直接投入到37—40℃温水浴中进行解冻的方法。解冻的升温速度为500—750℃/min，大多数植物材料可采用此种方法。解冻方法有快速解冻和慢速解冻两种。b、慢速解冻法将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻，再逐渐升至室温下进行解冻的方法。适宜细胞含水量较低的材料。如木本植物的冬芽。（5）再培养指将已解冻的材料重新置于培养基上使其恢复生长的过程。再培养是检验冷冻保存效果或确定保存方法是否合适的最根本方法。3、影响因素◆预处理◆冷冻◆解冻方法◆植物材料的性质◆冷冻保护剂的使用所使用的冷冻保护剂应具有以下特性：◆分子质量较小◆易于与溶剂混合◆快速渗入细胞◆无毒或毒性小◆易洗脱常用的是DMSO。冷冻保护剂的作用：◆降低冰点，促进过冷却和“玻璃化”状态形成◆提高溶液黏滞性，阻止冰晶形成◆增加细胞膜透性，加速胞内水分向外渗出◆稳定细胞内大分子正常结构，阻止低温对膜的伤害4、超低温保存后细胞或组织活力检测◆根本方法是再培养◆染色法：FDA、伊凡蓝法、TTC等存活率公式存活率（%）=×100%重新生长的细胞（组织）数解冻的细胞（组织）数（三）生长抑制剂保存主要包括高渗保存法、生长抑制剂保存法、饥饿法、矿物油覆盖法、低光照培养法及低压保存法。1、高渗保存法利用培养基的高渗透压来抑制离体培养材料生长的种质保存方法。高渗物质：甘露醇、蔗糖、PEG等高渗保存配合低温效果更明显如：6~10℃低温下，培养基中加4%甘露醇，可保存马铃薯1~2年，存活率最高可达90%以上。2、生长抑制剂保存法在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料的生长，达到长期保存种质材料的保存方法。生长调节剂：ABA、青鲜素、CCC、多效唑、B9等使试管苗生长缓慢，生长健壮、叶色浓绿、移栽成活率高。3、饥饿法从培养基中减去1~2种营养元素，使植株缺乏相关营养而处于最小生长量4、矿物油覆盖法使培养材料与空气隔绝，延缓生长5、低光照培养适当减弱光照强度，缩短光照时间，进而减缓试管苗生长6、低压保存降低培养材料周围气压，达到抑制生长的目的分为低气压与低氧压两种，保存原理相似