第三章 细胞培养的基本方法

第三章细胞培养的基本方法培养细胞的细胞生物学细胞分离技术第一节培养细胞的细胞生物学基本概念体外培养细胞的分型培养细胞的生长和增殖过程一、基本概念1组织块培养（tissueblockculture）2离散的细胞培养(dissociatedcellculture)3单（个）细胞培养(singlecellculture)4群体培养（massculture）5细胞克隆（clone）二、体外培养细胞的分型（一）贴附型大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。2、上皮型细胞细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。3、游走细胞型呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别4、多型细胞型有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。（二）悬浮型见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。三、培养细胞的生长和增殖过程（一）培养细胞生命期所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段：1．原代培养（PrimaryCulture）期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大2．传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系3．衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（二）组织培养细胞一代生存期潜伏期增殖期停滞期细胞贴附于支持物后，除先经过延展过程变成极性细胞后，经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期2．指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂（MitoticIndex：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。3．停滞期（StagnatePhase）：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好四、原代培养培养物一经接种到培养器皿（瓶）中就不在分割，任其生长繁殖原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫HenriettaLacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成五、传代培养当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代六、生长曲线细胞接种入培养瓶后，先进入2-24h的延迟期（lagperiod），然后进入指数生长期（即对数期）（logphase），汇合成单层进入缓慢生长或停滞期（即平台期）（plateaulhase）。每种细胞系（cellline）的这些生长期（growthphase）都是特征性的，只要环境条件保持恒定，每一次测定结果应该是可重复的第二节细胞分离技术从原代组织中分离细胞从原培养容器中分离细胞一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法1.胰蛋白酶(Trypsin)●在去除不需要的组织后，把剩余的组织切成3~4mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。●加入0.25％溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。●在4℃孵育6到18小时。●在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。●在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。●通过无菌不锈钢丝网（100～200mm）过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。2.胶原酶(Collagenase)●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片●加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS中）。●在37℃孵育4到18小时。加入3mMCaCl2增加解离效率。●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞。●在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。3.Dispase●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片●加入Dispase（0.6～2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液）●在37℃孵育20分钟到几个小时。●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的●计数和接种细胞，进行培养二、从原培养容器中分离细胞以下是从基层迅速分离细胞，且保持细胞完整性的一般步骤。这一步骤并不意味着对于所有细胞系的广泛应用，每一种系统最佳条件和施用浓度应该根据经验加以确定。1.移弃使用过的细胞培养基。2.使用不包含有钙镁的平衡盐溶液清洗细胞3.加选择的分离液到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆盖细胞层。在37℃孵育培养瓶，轻轻摇动培养瓶4.当细胞完全分离时，垂直放置培养瓶，让细胞流到培养瓶的底部第三节细胞的冻存与复苏为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异，有时因寄赠、交换和购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，最佳的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。一、细胞的冻存为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下：1.包含10％甘油的完全培养基，2.包含10％二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基，3.50％细胞条件培养基和50％含有10％甘油的新鲜培养基，或4.50％细胞条件培养基和50％含有10％二甲基亚砜的新鲜培养基。对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是：5.50％细胞条件无血清培养基和50％包含有7.5％二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基，或6.包含有7.5％二甲基亚砜和10％细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。1.悬浮细胞1).计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200～400g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。2).以1×107到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5×107到1×107在无血清培养基中，再次悬浮细胞。3）.分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。4）.细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。2.贴壁细胞1).使用分离试剂从基层分离细胞2).在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。以大约200g离心5分钟沉淀细胞3).以5×106到1×106细胞/ml密度4).细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。二、冻存细胞的复苏冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中1.直接铺板方法●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。●直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。●培养细胞12到24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。2.离心方法1)取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。2)把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。3)以大约80xg离心2到3分钟。4)弃去上清。5)在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。6)细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。三、细胞的分化、衰老与死亡1．细胞的分化:一个成年人全身细胞总数约1012个，可以区分为200多种不同类型的细胞：形态结构，代谢，行为，功能等各不相同。追根溯源，这么多种细胞均来自一个受精卵细胞。所以，通常把发育过程中，细胞后代在形态、结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化。细胞分化发生在胚胎阶段，也发生在胎儿出生以后，乃至成人阶段。例如，人体血细胞的产生和分化，这个过程在人的一生中一直持续着2．细胞的衰老体外细胞培养实验证明:成纤维细胞：来自胎儿传代50次后衰老死亡,来自成人传代20次后衰老死亡(与具体年龄有关);来自小鼠传代14--28次后衰老死亡第四节细胞计数及活力测定一、原理培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力二、仪器、用品与试剂1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇3、材料：细胞悬液三、操作步骤（一）细胞计数1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/m