一般毒性作用(1)

第六章一般毒性作用(generaltoxiceffect)预防医学专业课程《毒理学基础》第6版(人卫社）王心如主编中南大学公共卫生学院毒理学系曾明本章内容第一节概述第二节急性毒性作用第三节局部毒性作用第四节短期、亚慢性和慢性毒性作用一、一般毒性作用的概念和意义概念：一般毒性作用(generaltoxiceffect)是指外源性化学物在一定剂量、接触时间和接触方式下对机体产生综合毒性效应的能力，也称为基础毒性(basictoxicity)，是与特殊毒性相对应的概念。一般毒性作用可分为急性毒性、亚急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性作用。第一节概述外源性化学物毒性toxicity特殊毒性specialtoxicity一般毒性generaltoxicity化学物以一定剂量、接触时间与方式作用于机体引起的综合性效应。特点：剂量-反应关系比较明显，发生率高，基本符合毒理学规律，个体差异相对较小，重现性较高。如致死、脏器损害、局部刺激等化学物作用于机体引起的一类特殊的损害效应。特点：机制复杂、毒理学规律不明显、影响因素多、个体差异大等。如致癌、致突变、致畸等一般毒性作用评价试验项目：❖急性毒性试验❖局部毒性试验眼刺激试验皮肤刺激试验皮肤致敏试验❖短期（重复剂量）毒性试验亚慢性毒性试验慢性毒性试验一般毒性评价和研究的目的：1.确定受试物毒作用的表现和性质2.确定受试物毒作用的剂量反应（效应）关系3.确定毒作用的靶器官4.确定损害的可逆性一般毒性评价和研究的意义：一般毒性评价是探讨外源性化学物对机体损伤的重要基础资料，是进行外源性化学物安全性评价和危险度评估的重要组成部分，对防止外源性化学物急性毒性危害、制定安全卫生标准以及管理毒理学的决策具有重要意义。二、一般毒性试验的动物选择和染毒方式(一)实验动物选择：1.物种和品系2.级别和性别3.年龄和体重4.生理与健康状况第一节概述1.物种和品系(一)实验动物的选择原则：①选择对受试物的代谢和毒效应表现与人的反应最接近的试验动物②动物易于获得且价格较低，寿命适宜③易于饲养和实验操作的物种④品系纯化最好用两种种属的动物(亚慢性和慢性试验)啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：犬或猴•急性经口、经皮或吸入毒性试验：大鼠•皮肤刺激、眼刺激试验：家兔•皮肤致敏试验：豚鼠1.物种和品系(一)实验动物的选择昆明种小白鼠级别：使用Ⅱ级(清洁级)或Ⅱ级以上动物性别:一般要求雌、雄各半•如已知动物对受试物的敏感性有性别差异，则应选择敏感性别•如实验结果发现雌雄动物间存在差异，则应将雌性、雄性动物的实验结果分别进行统计2.级别和性别(一)实验动物的选择实验动物年龄的选择主要取决于试验类型和评价的目的：•急性试验：刚成年的动物，通常以体重来表示：大鼠180～240g，小鼠18～25g，家兔2～2.5kg，豚鼠200～250g，狗10～15kg。•亚慢性和慢性试验：初断乳的动物，大鼠50～100g（≤6w)，犬4-6月（≤9月)要求同一试验中，相同性别动物的起始体重不应超过实验动物平均体重的±20%3.年龄和体重选用健康动物,雌性动物应选用未产未孕者通过实验前约5-7天的检疫期，观察动物的一般情况，如行为活动、饮食、大小便等大鼠和犬的亚慢性和慢性试验，实验前采血进行血液学和血液生化学检查，以剔除异常动物；对狗应在实验前常规驱除肠道寄生虫4.生理与健康状况(二)染毒方式染毒方式的选择需考虑：1.模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；2.有利于不同化学物之间一般毒性大小的比较；3.受试物的性质和用途；4.各种受试物毒性评价程序的要求等。一般毒性试验的染毒方式为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。经呼吸道染毒：吸入染毒(静式吸入和动式吸入)，气管注入经口(消化道)染毒：灌胃法，喂饲法和胶囊法经皮肤染毒：经皮涂抹（定量）和浸尾法（定性）注射染毒：静脉、肌肉、皮下、腹腔注射等灌胃腹腔注射皮下注射尾静脉注射小鼠浸尾染毒装置一、急性毒性的概念二、急性毒性试验目的三、急性毒性试验方法要点四、急性毒性分级第二节急性毒性作用急性毒性是指实验动物一次接触或24小时内多次接触一定剂量外源化学物后在短期内所产生的健康损害作用（毒效应）和致死效应。急性毒性概念中有几个问题需要注意：•急性接触的次数：一次或多次（24h内）•中毒效应出现的时间：一般观察14d•中毒效应的强度一、急性毒性的概念■经口和注射接触：“一次”是指在瞬间将受试化学物输入实验动物体内■经呼吸道吸入与经皮肤接触：“一次”是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化学物的过程（呼吸道吸入2-6h，皮肤接触4h）所以“一次”含有时间因素“一次”的含义对于毒性很低或溶解度很低的化合物：一次染毒所需的化学物的体积超出了某种染毒途径的最大容许体积，因此只能在一个较短的时间内（24h内）分次（2～3次）给予（每次至少间隔4小时）。24h内“多次”接触1.确定受试物的一系列急性毒性参数，其中以LD50为最主要的参数，并对化学物的急性毒性进行分级2.通过观察实验动物中毒表现和死亡情况，初步评价受试物对动物的毒性和对人体产生损害的危险性大小、毒效应特征、靶器官和剂量-反应关系等。3.为亚急性、亚慢性、慢性毒性试验以及其他毒理学研究染毒剂量设计和观察指标选择提供参考。4.为化学物毒作用机制研究提供初步线索。二、急性毒性试验目的毒性试验剂量设置参考试验类别剂量设计短期试验1/20-1/5LD50范围设组亚慢性试验1/20-1/5LD50作最高剂量慢性(致癌)试验1/20-1/10LD50作最高剂量(一)经典的急性毒性试验(二)急性毒性替代试验(三)急性毒性作用观察二、急性毒性试验方法要点(一)经典的急性毒性试验OECD的毒性评价指南对传统LD50法的基本规定：•实验动物首选大鼠•动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20%•应设足够的剂量组(至少3组，一般5-7组)，组距适当，可观察到明显的毒性和不同的死亡率，以得到剂量反应关系并求得LD50•每组至少雌、雄各5只动物•一般应至少观察14天，临床观察每天至少一次①中毒症状②体重：于染毒前、染毒后每周和死亡时测定体重③死亡情况与数量（死亡数用于计算LD50）④病理形态学变化：所有动物应进行大体解剖，记录观察到的病变，必要时进行组织病理学检查毒效应观察内容霍恩(Horn)法改良寇氏(Karber)法Bliss法最大耐受量法概率单位图解法常用的LD50(或LC50)计算方法经典试验方法要求：①4个剂量组，每组动物数相等（4只或5只）②雌雄分开试验③每组剂量为固定倍数递增（2.15倍，3.16倍）特点：①动物用量少②简便（查表可得LD50及95%可信限）③精确度不高1.霍恩(Horn)法–又称剂量递增法霍恩(Horn)法查表-2.15倍组距霍恩(Horn)法查表-3.16倍组距某药经预试验得知其致死剂量范围为100~1000mg/kg，根据霍恩法，如何确定正式试验剂量？1.选择染毒剂量系列Ⅰ：剂量组距为2.15倍，剂量系列为：1×10t，2.15×10t，4.64×10t，10×10t2.确定t=23.正式试验剂量（单位：mg/kg）为100，215，464，1000实例要求：①5～7个剂量组，每组动物数相等；②死亡率呈正态分布；③最低剂量组死亡率＜20%，最高剂量组死亡率＞80%；④各组剂量呈等比级数。特点：①计算结果简便（按公式计算）②精确度高2.改良寇氏(Karber)法-又称平均致死量法lgLD50＝Xk－i(p－0.5)pqSm＝inlgLD50的95%可信限＝(lgLD50±1.96Sm)LD50计算公式：应用实例又称最大似然法，被认为是最精确的LD50计算方法我国《新药临床前药理毒理学研究指导原则》推荐用Bliss法进行LD50的计算特点：计算比较复杂（Bliss法计算LD50软件）3.Bliss法Bliss法计算LD50软件有的化学物毒性非常低，或是无毒的化学物，在急性毒性试验中当给予最大耐受剂量，或达到规范所规定的最大限量或以上时，实验动物仍无明显毒性体征，或虽有毒性体征，但无死亡，此时可不再求LD50，而求出最大耐受剂量（MTD）。一般来说，化学物LD50如大于5g/kg已表明毒性不大，在农药和化学品的规范中规定，LD50如大于5g/kg可不再往高的剂量进行试验，但不同的规范可有不同要求，如食品规定为20g/kg。4.最大耐受量(MaximumTolerableDose,MTD)法预试剂量死亡数/动物数5000mg/kg0/3正式试验可只设一个剂量：5000mg/kg动物数量：20只（雌雄各半）实例经典急性毒性试验的局限性(1)消耗的动物量较大(2)获得的信息有限(3)测得的LD50仅仅是一个近似值且波动性大(4)在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。(二)急性毒性替代试验符合动物保护和动物福利的“3R”原则OECD发布了替代传统LD50法的3种急性毒性试验：•固定剂量法•急性毒性分级法•上下法•限量试验：即最大耐受量法，并不是真正的替代法方法要点：①观察指标是明显毒性，而非死亡，故结果不是具体的LD50值；②设置5、50、500或2000mg/kg剂量组；③选择上述某一剂量为染毒起始剂量，根据试验结果(存活率、中毒表现)调整下一次剂量，如该剂量组100%存活而且无中毒表现，则再用高一档剂量重试，如存活＜100%，则再用低一档剂量重试；④最后按FD法评价表评价急性毒性。固定剂量法（fixeddosemethod,FD法）单次口服固定剂量试验结果的评价(fixeddosemethod,10只/次,雌雄各半)剂量(ml/kg)试验结果100%存活100%存活,毒性表现明显100%存活,无明显毒性表现5高毒有毒用50mg/kg试验50有毒或高毒(用5mg/kg试验)有害用500mg/kg试验500有毒或有害(用50mg/kg试验)有害用2000mg/kg试验2000(用500mg/kg试验)该化学物无严重急性中毒危险性-不分级以死亡为终点的分阶段试验法；采用啮齿类动物，首选大鼠，每阶段单性别动物3只开始剂量为5、50、300、2000mg/kg之一；分阶段进行，根据各阶段的结果决定下一步试验；⑴不需进一步试验即可行分级⑵以相同剂量染毒另一性别的动物，根据结果决定终止/升高/降低一档剂量⑶以较高或较低的剂量染毒同一性别的动物该法用动物少，可得到可接受的结论；该法基于生物统计学原理，通过OCED组织的国际性验证。急性毒性分级法（acutetoxicclassmethod）要求：先以一个剂量进行一个动物试验，如动物死亡（观察48小时），则以下一个较小剂量试探，若动物仍然死亡则以下一个更小剂量试探；如动物存活，则以较大剂量试探，依次类推，最终按公式计算LD50值。特点：①节省动物（一般仅需6-10只单性别动物）；②可进行毒性表现的观察，可估算LD50值及其可信限；③适用于毒性反应快速的化学毒物。上下法(up/downmethod，序贯法)上下法计算公式：应用实例LD50单位一般是mg/kg，LC50的单位一般是mg/m3或ppm。是指在试验过程中引起半数实验动物死亡的剂量或浓度，相对于最小致死剂量、绝对致死剂量其准确性、重现性都比较好，是一个很重要的急性毒性参数，通常作为比较不同化学物急性毒性大小的重要依据以及化学物毒性分级、标签管理的基础。四、急性毒性分级与评价WHO急性毒性分级外来化学物的急性毒性分级（WHO）国内健康相关产品毒性分级国内健康相关产品毒性分级表示LD50时应注意标明：◇动物品系、性别；◇染毒途径；◇95%可信限范围：LD50±1.96S例如：90%五氯酚钠原药对雄性SD大鼠急性经口LD50值为147mg/kg，其95%可信限范围为85.3～253mg/kg。LD50的毒理学意义：化学物急性毒性分级化学物之间、不同染毒途径毒