流式细胞仪基本原理

BDFACSCalibur流式细胞仪[e-mail]13811804801刘尉流式细胞术的基本概念•流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）就是利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中得单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。流式细胞仪的检测范围细胞结构•细胞大小•细胞粒度•细胞表面面积•核浆比例•DNA含量与细胞周期•RNA含量•蛋白质含量细胞功能•细胞表面/胞浆/核的特异性抗原•细胞活性•细胞内细胞因子•酶活性•激素结合位点•细胞受体•细胞内钙离子流式细胞仪的组成和工作原理电子处理系统-数据分析形式光学系统-检测信号液流系统-流动室流式细胞仪分析过程液流系统液流系统-FLOWCELL(流动室)InjectorTip荧光信号聚焦的激光光束鞘液电子处理系统-数据分析形式光学系统-检测信号液流系统-流动室散射光信号FALSSensorLaser散射光信号RightAngleLightDetectorCellComplexitySSC（复杂）ForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSC（大小）IncidentLightSource=前向角散射光（FSC,ForwardScatter）细胞相对大小及其表面积=侧向角散射光（SSC,SideScatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性前向角散射光信号侧向角散射光信号外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）荧光信号•使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析•荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号双色直接染色荧光素的激发和发射光谱•任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（nm）•激发光谱（Excitation，Ex）：•是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。•吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max•发射光谱（Emission，Em）：•是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光•发射波峰（最大发射波长）：Em-Max•荧光素的使用：•选择正确的激光器•确定所需探测器（PMT）区别488nm520nm异硫氰酸荧光素（FITC）光学系统：滤光片•如何将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？•滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围Longpass(LP)Shortpass(SP)Bandpass(BP)460500540460500540460500530SP500LP500BP500/50FluorescenceSpectrumViewer电子处理系统-数据分析形式光学系统-检测信号液流系统-流动室流式细胞仪数据分析数据存储:LISTMODE数据显示:直方图(Histogram)二维点图(DotPlot)等高线图(ContourPlot)密度图(Density)三维图（3DPlot）等FSCSSCFL1FL2Event13060638840Event210016024585Event3300650160720单参数直方图分析双参数散点图分析等高图和密度图流式对照的设置重点实验样本荧光•实验样本（自发荧光＋非特异荧光＋特异荧光）•自发荧光即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号•非特异荧光即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光•特异荧光即抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光流式对照的设置•空白对照：自发荧光•自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强同型对照（IsotypeControl）•同型对照：自发荧光＋非特异荧光与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型Fc段相同，F(ab’)段不同用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色•与染色的单克隆抗体①相同种属来源②相同免疫球蛋白及亚型③相同荧光素标记④相同剂量和浓度⑤但由未免疫动物血清纯化而来No.AntibodyIsotypeMouseanti-human未免疫Mouse血清纯化而来1A-FITC（γ1）γ1-FITC2B-PE（γ2a）γ2a-PE商业化荧光素的发射光谱spectraloverlapFluorescenceSpectrumViewerspectraloverlap如何解决？spectraloverlap荧光补偿•荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectraloverlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号已染色样本？真双阳？假双阳？双色荧光补偿双色荧光补偿双色荧光补偿补偿原则：均值相等（相当于横平竖直）双色荧光补偿的设置•使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色分析类型管功能加入的抗体双色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE※几色分析需要制备几个补偿对照管BD为您提供的帮助BD生物科学——流式整体方案提供者COE卓越中心400-819-9900热线电话Cytometry流式技术BBS&网络课堂@BD流式资讯新浪微博BD生物科学中文网BDProductsBD生物科学——流式整体方案提供者•卓越中心CenterofExcellence（COE）——前所未有的流式4S体验•Showcase产品展示•Support技术支持•Service售后服务•Survey用户调查•BD生物科学热线电话:400-819-9900•产品咨询•技术解答•仪器维修•意见反馈BD生物科学——流式整体方案提供者•BD生物科学中文网••内容及时更新，海量资料下载•在线联系BD支持人员•Cytometry流式技术BBS&网络课堂•资料查询和在线讨论•两周一次专家在线讲课互动•新浪微博@BD流式资讯•好玩，好看，流式也时尚生物科学——流式整体方案提供者•BD生物科学中文网••内容及时更新，海量资料下载•在线联系BD支持人员•Cytometry流式技术BBS&网络课堂•资料查询和在线讨论•两周一次专家在线讲课互动•新浪微博@BD流式资讯•好玩，好看，流式也时尚生物科学——流式整体方案提供者Committed最专注的品牌Comprehensive最丰富的产品Customized最特色的定制Customr-orientied最全面的服务谢谢！[e-mail]13811804801刘尉