第十一章 干细胞分化

第十一章干细胞分化干细胞分化在多细胞生物体的每一个体细胞中，遗传物质的组成是相同的。然而，在不同类型的细胞中，其基因的表达模式并不完全相同。在某一特定类型细胞中，某些基因处于活跃表达状态，而另一些基因处于沉默状态;在另一种不同类型的细胞中，基因表达的种类、数量及程度与前一种类型的细胞可能存在极大的差异。在多细胞生物体通过细胞增殖使细胞数目不断增多的过程中，伴随着细胞的分化，即产生多种类型的细胞。细胞分化是不同细胞中基因表达模式不同的结果。干细胞分化胚胎干细胞的分化成体干细胞的分化（1）造血干细胞的分化（2）神经干细胞的分化（3）肌肉干细胞的分化胚胎干细胞的分化高等哺乳动物个体是由一枚受精卵发育而来的。早期胚胎(4-细胞及以前的胚胎)中的每一个卵裂球都具有发育的全能性(totipotent)，即一个卵裂球就具有发育为一个完整个体的能力。随着发育的进行，胚胎中的细胞数目不断增多，细胞的多潜能性也在逐渐丧失。胚胎干细胞的分化当胚胎发育到囊胚(blastula)阶段，其中的细胞已分为两大类，位于外围的细胞被称为滋养层细胞(trophoblast)，这部分细胞将发育为胎盘；位于滋养层内部的细胞团被称为内细胞团(innercellmass，ICM)，这部分细胞将发育为胎儿。胚胎干细胞的分化细胞发育潜能的逐渐丧失可以形象地比喻为一个小球沿着山坡向下滚动，小球所具有的势能看做是细胞的发育潜能，被标注在图的左侧；这一期间细胞中的表现遗传修饰状态标注在图的右侧。胚胎干细胞的分化1.维持ES细胞多潜能性的表现遗传修饰所谓的ES细胞，是指ICM经体外培养后，所形成的具有自我更新及多分化潜能(pluripotent)的细胞。ES细胞主要通过多种类型的表现遗传修饰维持其多潜能性，这些表观遗传修饰类型包括DNA甲基化、组蛋白修饰、组蛋白变体、ATP依赖的染色质重塑以及RNA干扰(RNAinterference，RNAi)等。胚胎干细胞的分化ES细胞与已分化的体细胞在染色质结构方面存在极大的差异，这种结构的差异化正是不观遗传修饰的结果。（1）在ES细胞的基因组中，常染色质(euchromatin)的区域大于体细胞中的常染色质域。（2）与体细胞的染色质相比，ES细胞的染色质呈现出一种更为松散的状态。这种松散的态意味着DNA与组蛋白八聚体的结合并不是非常僵硬、死板，也就是染色质呈现为一种超动态(hyperdynamic)的结构。超动态染色质(hyperdynamicchromatin)被认为是ES细胞基因组具有可塑性的原因。胚胎干细胞的分化（3）ES细胞基因组中具有较多的组蛋白乙酷化修饰及组蛋白H3赖氨酸4甲基化修饰(H3K4me);具有较少的组蛋白H3赖氨酸9三甲基化修饰(H3K9me3)。对于ES细胞抑制发育、分化相关基因表达的问题有至少两种观点。第一种观点认为，ES细胞采用26S蛋白酶体(proteasome)移除发育、分化相关基因启动子上的PIC(例如RNA聚合酶E及基因特异性的转录因子等)，从而阻止这些基因的表达。另一种观点就是染色质双向(bivalent)区域机制。胚胎干细胞的分化（4）在ES细胞的基因组中，重要的发育相关转录因子的启动子区域既富含有组蛋白H3赖氨酸27甲基化修饰(H3K27me)，又富含有H3K4me修饰。ES细胞可以采用染色质的双向区域调控发育、分化相关基因的表达。在ES细胞中，染色质的双向区域可以使发育、分化相关转录因子基因的表达维持在一个较低的水平，但允许这些基因预期的活跃表达。染色质双向区域就像一个双向开关一样，可以灵活、有效地调控基因的表达和沉默。虽然染色质双向区域理论是一个被人们广泛认同的、有关m细胞调控基因表达模式的理论，但某些基因的启动子区域不具有双向区域。胚胎干细胞的分化（5）尽管ES细胞中可以高水平地表达DNA从头甲基转移酶(denovoDNAmethyltransferase的，但ES细胞基因组范围内的DNA甲基化水平低于体细胞基因组范围内的DNA甲基化水平。ES细胞与体细胞在DNA甲基化修饰方面还存在另一个差异，即前者会对非CpG二核昔酸的某些胞嘈院进行甲基化修饰。胚胎干细胞的分化胚胎干细胞的分化2.细胞分化过程中的表观遗传修饰机理人们可观察到的ES细胞分化事件包括多潜能性的降低甚至丧失以及三个原始生殖层(primordialgermlayer)的形成。但在这些可观察到的事件发生之前，ES细胞中一定发生了大量基因表达改变的事件。其原因在于：一方面这些事件持续的时间太为短暂，采用我们目前的技术还无法检测；另一方面当这些早期事件发生时，ES细胞在形态及特征方面还未发生改变，人们无法知道哪些ES细胞发生了分化，进而对其进行研究；胚胎干细胞的分化第三，在体外进行的研究中，ES细胞的分化似乎带着一定的随机性，这可能是由于ICM来源的ES细胞具有一定的异质性，抑或环境因素的影响使不同ES细胞受到的刺激信号不同，从而使ES细胞的分化表现为一定程度的随机性。胚胎干细胞的分化在ES细胞的分化过程中，开放的染色质结构会逐渐被替换为更为约束的结构。这种更为约束的染色质结构限定了基因组中可表达的基因种类。人们认为组蛋白H3的磷酸甜修饰使ES细胞中开放的染色质结持转变为约束的染色质结构，并为其他的表观遗传修饰铺平道路。在接下来的分化过程中，染色质双向区域的组蛋白进一步发生修饰变化，需要沉默的基因，其基因表达调控区的双向区域丢失H3K4me修饰，保留甚至扩大H3K27me的修饰范围，进一步增加异染色质特异的表观遗传修饰模式。成体干细胞分化成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。成体干细胞自我更新和分化能力的维持也是依靠其基因组中各种类型的表观遗传修饰。在成体干细胞向特定类型细胞分化的过程中，也伴随着大量的表现遗传变化。造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSCs)分化神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)分化肌肉干细胞分化造血干细胞分化人们用等级造血系统(hierarchicalhematopoieticsystem)定义造血干细胞在分化过程中所形成的中间类型细胞及终末分化细胞之间的关系，即造血系统中不同类型细胞具有等级性，下一级细胞由上一级细胞分化而来。在等级造血系统中，上一级细比下一级细胞具有更为广泛的分化潜能。造血干细胞分化长期/短期造血干细胞(long/hematopoieticstemcells，LT-HSCs/ST-HSCs)CLP及CMP为两大细胞分支。前B细胞(Pro-Bcell)、前T细胞(Pro-Tcell)自然杀伤细胞前体细胞(naturalkillerprecursor，NKP），双潜能的粒细胞-巨嗜细胞前体细胞(bipotentgranulocyte-macrophage，GMP)双潜能的巨核细胞-红细胞前体细胞(bipotentmegakaryocyte-erythrocyteMEP);造血干细胞分化小鼠自身的巨嗜细胞集落剌激因体(thereceptorforthemacrophagecolony-stimulatingfactor，c-fms)基因在造血干细胞中已经表达。在造血干细胞向不同类型终末细胞分化的过程中，该基因的表达模式也不相同。在造血干细胞向巨噬细胞分化的过程中，该基因的表达会上调;在LPS剌激的细胞中，该基因的表达会下调；而在所有的非巨噬细胞中，该基因会沉默。然而在未成熟的B淋巴细胞中，该基因并未完全沉默，直到成熟的B细胞阶段，该基因的表达才完全停止下来，随后该基因的DNA才发生全新的甲基化。在造血干细胞向T细胞分化的过程中，c-fms基因较早地停止了表达，且该基因的DNA也较早地发生了甲基化。造血干细胞分化造血干细胞分化在造血干细胞向B细胞及T细胞分化的过程中，c-fms基因沉默的时间及其发生DNA甲基化的时间不同。发生这种差异的原因可能在于:结合于c-fms基因启动子及增强子上的转录因子（如PU.1）在巨噬细胞及B细胞中依旧能够表达，这些转录因子的结合阻碍了c-fms基因的启动子及增强子发生DNA甲基化，从而使该基因仍旧能够表达;而在T细胞中，相应的转录因子已经停止表达，c-fms基因的启动子及增强子随即发生了DNA甲基化，从而使该基因完全沉默。造血干细胞分化近年来的研究表明，造血干细胞在向不同细胞系分化的过程中，仍然具有一定的可塑性，即分化过程中所形成的表现遗传修饰模式可以发生改变，从而使分化过程中形成的一些中间类型细胞具有转分化(trans-differentiation)的能力。因此，采用等级造血系统这一概念来描述造血系统巾各种细胞类型之间的关系是不确切的。转分化不仅仅是造血干细胞分化过程中的一种现象，在胚胎干细胞及其他成体于细胞的分化过程中也观察到转分化现象。神经干细胞分化神经于细胞(neuralstemcells，NSCs)具有自我更新及向神经元(neuron)、星形胶质细胞(astrocyte)及少突胶质细胞(oligodendrocyte)分化的能力。在分化过程中，其基因组DNA上会发生一系列的表现遗传修饰变化，包括DNA甲基化、组蛋白甲基化及乙酷化、非编码RNA(noncodingRNAs)的于扰等。神经干细胞分化(1)DNA甲基化对NSCs分化的影响在NSCs的分化过程巾，细胞类型特异性基因的DNA序列会发生去甲基化，在相应的转录因子及细胞因子作用下，这些基因会由抑制状态转变为活跃表达状态，从而建立起细胞类型特异性的基因表达模式，最终使NSCs分化为该种类型的神经细胞。神经干细胞分化神经干细胞分化在娃振中期的胎儿体内，Notch腺体在神经元前体细胞以及早期形成的神经元中就已经开始表达。Notch腺体的表达可以激活残存的NSCs中的Notch信号通路。一旦Notch被其腺体激活，Notch细胞内区域(Notchintracellulardomain，NICD)从质膜上，释放出来井上调核因子…1A(nuclearfactor1A，NFlA)的表达，后者可以阻止DNMT1结合到星形胶质细胞特异性基因(包括gfaρ基因)的启动子区域，从而导致这些基因的启动子区域去甲基化神经干细胞分化(2)组蛋白修饰对NSCs分化的影响与DNA甲基化修饰相比，组蛋白修饰更为多样和复杂，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、苏素化、糖基化、生物素化、羰基化及ADP核糖基化等多种类型修饰。在上述多种类型修饰中，组蛋白赖氨酸残基上的甲基化及乙酰化修饰是研究得最为清楚的两种组蛋白修饰方式。神经干细胞分化(3)非编码RNA对NSCs分化的影响在各种类型的RNA中，有关微小RNA(microRNA，miRNA)对NSCs分化的影响研究得最多。神经干细胞分化miR-124a主要在神经组织中表达。体外的研究表明，miR-124a可以降解非神经元基因的转录本，使NSCs向神经元分化。miR-124a的表达受神经元限制性沉默因子/RE-1沉默转录因子的抑制，后者仅在NSCs及非神经元的细胞中表达。过表达miR-124及miR-9都会促进NSCs向神经元分化;反之，下调这两种miRNA的表达会使NSCs向非神经元细胞分化神经干细胞分化在不同类型的神经细胞中.miRNA表达的种类不同，如:miR-128、miR-129及miR-298仅在神经元中表达;而miR-23仅在神经胶质细胞中表达;miR-26及miR-29则既在神经元中表达，又在神经胶质细胞中表达，但在后者中的表达量高于其在前者中的表达量。因此，对某种miRNA表达的调控可能是细胞内在的一种需要，且这种调控对于细胞的命运至关重要。肌肉干细胞分化在胚胎阶段的生肌前体细胞中表达Pax3及Pax7两种同源盒转录因子(homeoboxtranscriptionfactors).这两种转录因子对于生肌细胞系(myogeniccelllineage)的维持及特异性至关重要。出生后，这些生肌前体细胞