毛细管电泳法

毛细管电泳法CapillaryElectrophoresis,CE毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。一、毛细管电泳的原理二、分离模式一、毛细管电泳的原理装置毛细管数据处理电极检测器电极试样缓冲液缓冲液高压电源（可高至30KV）进样方法1、电动进样也称电迁移进样.方法:将毛细管的进样端插入装有试样溶液的试样管中，试样管中插入电极，与检测端的缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间，试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管，然后再将试样溶液换成载体缓冲液，电泳即可进行。2、流体动力学进样也称为虹吸进样、重力进样、压差进样方法:毛细管进样端插入试样溶液容器，通过进样端加压，或检测端出口减压，或调节进样端试样溶液液面大于出口端缓冲液液面高度，利用虹吸现象，使进样口端与出口端形成正压差，并维持一定时间，试样在压差作用下进入毛细管进样端，再把进样端放回缓冲液液槽中，进行电泳。电泳是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。电泳和电渗电渗是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。电渗与固液界面的双电层有着密切的关系CE所用的石英毛细管柱,在pH3情况下,其内表面带负电,和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下,双电层中的阳离子扩散层引起流体整体地朝负极方向移动，便形成电渗流，这种现象称为电渗。电渗流的速度与电场强度成正比，故电渗流淌度定义为单位电场强度下得电渗流速度：μeo=Veo/E粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和,正离子的运动方向和电渗流一致,故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反,但因电渗流速度一般都大于电泳流速度,故它将在中性粒子之后流出,从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。电渗流的流型特点a.毛细管中电渗流呈“塞式流”流型b.HPLC柱中压力驱动呈抛物线型电渗是CE中推动流体前进的驱动力，它使整个流体像一个塞子一样以均匀的速度向前运动，使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。但在HPLC中，采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型，其中心处速度是平均速度的两倍，导致溶质区带本身扩张，引起柱效下降，使其分离效率不如CE。电渗流的意义1.电泳过程中，伴随着电渗现象2.电渗流的速度比电泳速度快5－7倍3.利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析电渗流是毛细管电泳分离的重要参数控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。二、分离模式1毛细管区带电泳2胶束电动毛细管电泳3毛细管凝胶电泳4毛细管等速电泳5毛细管等电聚焦1毛细管区带电泳CZE也称为毛细管自由溶液区带电泳毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其它各种操作模式的母体川芎中川芎嗪和阿魏酸含量的毛细管电泳测定电泳条件：电泳溶液硼砂30mmol.L-1(pH9.43),检测波长295nm,34kPa.s压力进样，17kV恒压电泳，电泳时间10min，电泳温度20℃，进样分析溶液中均含硼砂3.0mmol.L-1(pH=9.43)。为消除进样等因素所引起的误差，采用内标定量法。实验发现p-NBA出峰时间在LIG与FA之间，在优化条件下样品中杂质对其无干扰，峰形好，用它作内标可明显改善分析精密度，故选定p-NBA为内标，在进样分析溶液中浓度为60μg.mL-1。1.Ligustrazin川芎嗪2.p-NBA对硝基苯甲酸3.Ferulicacid阿魏酸2胶束电动毛细管色谱MECC以胶束为假固定相的一种电动电泳在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂中的疏水基团可形成胶束，溶质因淌度和分配系数的不同而分离。SDS胶束的结构示意里面有一个疏水内核，外面布满了S03ˉ离子。测定半夏等药材中苯甲酸的含量SDS应用：分离中药熊胆中磷脂主组分SDC（脱氧胆酸钠）测定红丝线提取物中紫蓝素的含量β-CD3毛细管凝胶电泳CGE将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离。毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点:1.电泳峰尖锐，柱效极高2.短柱上实现极好的分离3.试样容量为10－12g主要缺点:制备柱较困难，寿命较短已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核酸、DNA等强有力的工具。例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相结合，用于DNA序列快速分析。4毛细管等速电泳CITP建立在试样中各组分的电泳淌度不同，等速电泳中被分析试样进样前后分别使用前导电解质溶液和终结电解质溶液，分离后的各组分区带以相同的电泳迁移速度通过检测窗口。前导电解质的电泳淌度应高于试样中各组分的电泳淌度，而终结电解质的电泳淌度则反之。假定有区带L，A，B，C，T，则各区带的移动速度为：vT=vA=vB=vC=vL或：TET=AEA=BEB=CEC=LEL式中，，有效淌度，E，电场强度由于T〉A〉B〉C〉L，所以有:ET《EA《EB《EC《EL各区带的电场强度不同。前导电解质区带的电场强度最小。若某一区带的离子进入前一区带，由于电场强度变小而减速，由若进入到下区带，由于电场强度变大而加速，都退回到原区带,结果导致各区带形成鲜明的界面.5毛细管等电聚焦CIEF1、毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；2、氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；3、聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；注意：电渗流在CIEF中不利，电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定，应消除或减小。特点:1.等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这一过程可用于浓缩试样组分。2.具有极高的分辩率，可以分离等电点相差0.01pH的两种蛋白质.