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TRIZOL®ReagentCat.No.15596-026Size:100mlStoreat2to8°C.警告:在与皮肤接触及吞咽有毒。可导致烧伤。与皮肤接触后,应立即用洗涤剂和大量水冲洗。如感到身体不适,应就医(如需要,应出示本产品标签)。本产品含有苯酚(108-95-2)和其他成分(NJTSRN80100437-5000P)。已经证明TRIZOL在室温下可稳定保存12个月。不过,我们建议在储存于2-8°C,以保证最佳性能。描述:TRIzol试剂(美国专利号,5346994)是即用型细胞和组织总RNA提取试剂。该试剂是一步法苯酚和异硫氰酸胍解决方案,是对Chomczynski和Sacchi开发的单步RNA提取法(1)的改善。在匀质化或溶解样品中,TRIzol试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分离成水相和有机相。RNA存在于水相。水相转移后,RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后,样品中DNA和蛋白质可通过相继沉淀回收(2)。用乙醇沉淀可从中间相得到DNA,加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质(2)。与DNA的共纯化可能对不同样品得到的RNA的归一化有用。此技术可完美应用于少量人类、动物、植物或细菌来源的组织(50-100毫克)和细胞(5×106),以及大量的组织(≥1g)和细胞(107)。该TRIzol试剂方法简单,允许大量样本同时处理。整个过程可在一小时内完成。用TRIZOL提取总RNA可避免蛋白质和DNA污染。可用于Northernblot分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。聚合酶链反应(PCR反应)中,当两条引物位于单个外显子时,推荐使用扩增级DNA酶I(Cat.No.18068)处理分离出的RNA。TRIzol试剂方便提取不同种类、不同分子大小的RNA。例如,从大鼠肝中提取RNA,经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,高分子量RNA离散带其长度可高达7kb和15kb,(组成mRNA’s和hnRNA’s),两个主要的核糖体RNA带在~5kB(28S)和~2Kb(18S)。低分子量RNA介于0.1和0.3kB之间(tRNA,5S)。分离出的RNA用TE稀释,其A260/A280比值≥1.8。防止RNA酶污染的注意事项通过不当的技术操作,RNA酶可在任何提取程序中意外引入RNA的制备中。由于酶的活性难以抑制,所以必须防止其引入。进行RNA工作时,下列准则应予以遵守。•总是戴着手套。皮肤上通常包含的细菌和霉菌,可污染RNA的制备,同时也是RNA酶的一个来源。良好的微生物操作技术可防止微生物污染。•使用无菌制品,专为RNA工作准备的一次性塑料器皿和自动吸管可以避免与共用设备的RNA酶交叉污染。例如,一个实验室正在使用的RNA探针可能用得上RNA酶A或RNA酶T1以减少过滤背景,其中任何非一次性物品(如自动吸管)可能是大量RNA酶的来源。•TRIzol试剂的存在,可保护RNA酶对RNA的污染。下游样品处理要求非一次性的玻璃器皿或塑料器皿无RNA酶。玻璃物品可以在150°C烘烤4小时,塑料制品,可浸泡10分钟的0.5MNaOH溶液,然后用清水彻底冲洗,并高压蒸汽灭菌。其他需要注意的事项:•用小于2毫升体积的TRIZOL试剂工作时,建议使用一次性透明聚丙烯管。•对于较大的体积,用玻璃(Corex)或聚丙烯管,并测试以确保该管装满TRIzol试剂和氯仿时可承受12,000×g的离心力,不要使用泄漏或有裂纹的管子。•离心前小心平衡管子的重量•玻璃管必须用封口膜密封,密封时封口膜要覆盖有螺丝处,聚丙烯管离心前必须盖好。RNA提取的指导:警告:当使用TRIzol试剂工作时,应使用手套,并保护眼睛(屏蔽、安全护目镜)。避免与皮肤或衣服接触。使用化学通风橱。避免吸入蒸气。除非特别注明,所有程序均在15-30°C下进行,试剂也放置于15-30°C。需要的试剂为:•氯仿•异丙醇•75%酒精(溶于DEPC处理的水中)•无RNase的水或0.5%SDS溶液[RNase-free水的准备:把水加入到RNase-free的玻璃瓶中,加入diethylpyrocarbonate(DEPC)至0.01%(v/v).静置过夜,高压蒸汽灭菌。SDS溶液必须使用DEPC处理的水,并高压灭菌。]1.均质化(seenotes1-3)a.组织均质50-100毫克组织样本需要1毫升的TRIzol试剂,使用特富龙玻璃®或强力均质机(Polytron,orTekmar'sTISSUMIZER®TISSUMIZER®或相当的仪器)。均质时样本体积不应超过TRIzol试剂体积的10%。b.单层细胞直接在培养皿中裂解细胞,3.5厘米直径的皿中加入TRIzol试剂1毫升,并通过抽吸几次促进细胞裂解。TRIzol试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目(每10平方厘米加入1毫升)。TRIzol试剂量不足可能会导致分离出的RNA有DNA的污染。c.悬浮细胞离心沉淀细胞。在TRIzol试剂中重复吹打以裂解细胞。1毫升试剂用于5-10×106的动物、植物或酵母细胞,或1×107细菌细胞。使用TRIzol试剂前应避免洗涤细胞,因为这增加了mRNA降解的可能性。一些酵母和细菌细胞的裂解可能需要使用均质器。可选:一些样品可能需要额外的分离步骤,这些样品蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高,如肌肉、脂肪组织、以及部分植物块茎。同质化之后,2-8°C、12000×g离心10分钟,移除不溶物。由此产生的沉淀含有细胞外膜结构、多糖、分子量高的DNA,而上清含有RNA。从脂肪组织等脂肪过多的样本收集的上层脂肪应弃去。在每种情况下,均应转移净化后的均质溶液到新管,加入氯仿进行下述相分离。2.相分离15-30°C孵育5分钟,以利于匀浆样品中核蛋白体完全分离。每1毫升的TRIzol试剂添加0.2毫升氯仿。小心盖好样品管。用手大力摇管15秒,15-30°C孵育2-3分钟。2-8°C,不超过12,000×g离心15分钟。离心后,混合物分离为红色下层(酚-氯仿相)、中间相以及上层的无色水相。RNA存在于水相。水相体积约为60%均质时使用的TRIzol试剂量。3.RNA沉淀水相转移到一个新管,并保存有机相(如希望分离DNA或蛋白质)。混合异丙醇以从水相中沉淀RNA。每1毫升用于初始的同质化的TRIzol试剂使用0.5毫升异丙醇。15到30℃孵育样品10分钟,2-8°C,不超过12,000×g离心10分钟。往往离心前RNA沉淀不可见,离心后在管侧面和底部形成一个凝胶样沉淀。4.RNA洗涤弃上清。用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂使用至少1毫升75%的乙醇。涡旋混合。2-8°C,不超过7,500×g离心5分钟。5.重新溶解RNA在该过程结束时,简单干燥RNA沉淀(空气干燥或真空干燥5-10分钟)。不要真空离心干燥RNA。重要的是不要让RNA沉淀完全干燥,因为这将大大降低其溶解度。部分溶解RNA样品,其A260/280比值1.6。在无RNA酶的水中或0.5%SDS溶液中吹打几次溶解RNA,并在55-60°C孵育10分钟。(如RNA将用于之后的酶反应,应避免使用SDS。)RNA也可以用100%甲酰胺(去离子)再溶解并保存于-70℃(5)。RNAIsolationNotes:1.从少量组织(1-10毫克)或细胞(102-104)分离RNA:加入800µlTRIZOL到thetissueorcells.样品裂解后,加入氯仿,遵循上述步骤2进行相分离。在异丙醇沉淀的RNA之前,加入5-10微克无RNA酶的糖原(Cat.No10814),以承载水相。为了降低粘度,加入氯仿前以2-26号针头剪切基因组DNA。糖原保留在水相,与RNA一起沉淀下来。浓度高达4mg/mL的糖原既不抑制第一条链的合成,也不抑制PCR。2.同质化后,加入氯仿前,样品也可以存放在-60至-70℃至少一个月。RNA沉淀(步骤4,RNA洗涤)可以存储在75%乙醇中2-8℃至少一周,或在-5至-20°C至少一年。3.最大离心力只有2,600×g的桌面型离心机也适合用于这些程序,只是在步骤2和3中,其离心时间应提高到30-60分钟。DNA提取的指导:如RNA分离方法所描述,完全除去水相后,位于中间相和苯酚相的DNA可被能分离。经沉淀和系列洗涤,DNA可溶解于8mM氢氧化钠。使用TRIzol试剂可从组织和培养细胞完全回收DNA,可用于分析样品DNA含量(2)。同时提取的基因组DNA可用于每个基因组northern结果的归一化分析,而不是使用变动更大的总RNA或组织的重量。(根据来源,在进行其他程序之前,获得的DNA沉淀可能需要额外纯化(如酚提取))。需要的试剂:•100%乙醇•0.1M柠檬酸钠in10%乙醇•75%乙醇•8mMNaOH除非特别注明,所有程序均在15-30°C下进行。1.沉淀DNA移去水相后,用乙醇沉淀中间相和有机相中的DNA。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加0.3毫升100%乙醇,颠倒混合。然后,15-30℃静置2-3分钟,2-8°C,不超过2,000×g离心5分钟以沉淀DNA。仔细移去水相,对于分离DNA的质量很重要。2.DNA洗涤移去苯酚-乙醇上清液(如需要,保存上清用于蛋白质分离)。用0.1M的柠檬酸钠溶液(溶于10%乙醇)洗两次沉淀的DNA。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加1毫升溶液。每次清洗时,15-30℃静置30分钟DNA沉淀(间歇混匀),2-8°C,2,000×g离心5分钟。洗涤2此后,用75%乙醇悬浮沉淀的DNA(每毫升TRIzol试剂加入75%乙醇1.5-2毫升),在15-30°C静置10-20分钟(间歇混匀),然后2-8°C,2,000×g离心5分钟。对于包含200µgDNA或大量非DNA物质的大沉淀,需要0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液额外的洗涤。3.重溶DNA打开离心管口,空气干燥DNA5-15分钟。(不要离心干燥,因为溶解更难。)用8mM氢氧化钠溶解DNA,至DNA浓度为0.2–0.3µg/µl。通常添加300–600µlof8mMNaOHtoDNAisolatedfrom107cellsor50–70mgoftissue.强烈推荐在弱碱中重悬,因为分离的DNA在水中或Tri缓冲液中不能重悬。8mMNaOH的pH值只有~9,一旦DNA溶解于其中,可以很容易的用TE或HEPES进行调节。在此期间,DNA(尤其是来自组织的DNA)中可能含有不溶性胶状物(膜碎片等等),12,000×g离心10分钟去除不溶物。将含DNA的上清转移到一个新管。在8mMNaOH中溶解的DNA可储于4°C过夜。如长期贮存,样品液应使用HEPES调整pH值至7-8(见表)并添加1mMEDTA。一旦pH值调整后,DNA就可以储存在4°C或-20°C。溶于8mMNaOH的DNA可在4℃保存数月,-20℃保存一年,-70℃未测定。DNA定量与产量预测:在8mMNaOH中溶解的DNA,取出一部分与水混合,并测量其A260的值。用A260的值计算双链DNA含量。1A260单位=50µg双链DNA/mL。按照样本细胞数计算,每1×106人、大鼠或小鼠二倍体细胞可分别产生:7.1µg,6.5µg和5.8µg的DNA(3)。每mg肝和肾组织产生3-4ugDNA,每mg骨骼肌、脑和胎盘可产生2-3ugDNA;每106人、大鼠和小鼠来源的培养细胞可产生5-7ugDNA。应用PCR扩增DNA:在8mMNaOH中溶解DNA后,用HEPES调整pH值为8.4(见表)。添加0.1-1.0µgDNA样本至PCR反应混合物,执行标准PCR程序。限制酶反应:用HEPES调整DNA溶液的pH至希望的值(见表)。样本也可用1mMEDTA,pH7-pH8.0进行透析。每µgDNA使用3-5个units的酶。对特殊的酶,使用酶制造商建议的条件,并让反应持续3-24小时。在一般实验中,80-90%的DNA可被消化。溶解于8mMNaOH的DNA样品的pH
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