实验五过氧化物同工酶分析

一、目的掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术的原理和操作方法掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理和方法二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）过氧化物同工酶及活性染色（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）P201.电泳概念电泳：带电粒子在电场中向与其电性相反的电极移动的现象。○○○○—++-+-（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）2.电泳分类显微电泳自由界面电泳区带电泳–纸电泳–醋酸薄膜电泳–琼脂糖凝胶电泳–聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）3.电泳法原理在一定条件下，任何带点颗粒都有自己特定的电泳迁移率。影响电泳迁移率的因素：颗粒性质：–净电荷数目–颗粒大小–颗粒形状电场强度：V/cm溶液性质：–缓冲液的pH–离子强度–溶液黏度–电渗：液体对固体支持物的相对移动聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）4.聚丙烯酰胺凝胶电泳反应过程TEMED催化AP生成硫酸自由基S2O82－2SO4·¯硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：Bis将单体长链间连成网状结构：PAGE法分离蛋白质的三种效应电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在同一电场中泳动率不同；分子筛效应；蛋白质分子大小和形状各不相同，在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各不相同，泳动率也不相同；浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带，即所谓浓缩效应，提高了条带分辩率。（只有不连续凝胶具有此效应）（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构及其理化性质不同的一组酶。同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中广泛存在。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。本实验采用PAGE技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。过氧化物+过氧化物酶→复合物复合物+DH2→过氧化物酶+H2O+DH2O2联苯胺棕色物质（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）三、材料、仪器和试剂材料：小麦幼苗仪器：电泳仪、电泳槽、高速离心机、量筒、烧杯、微量注射器、研钵、染色盒三、材料、仪器和试剂试剂：A液：30%Acr-0.8%BisB液：Tris+EDTAC液：TEMEDD液：10%AP电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3）0.5%溴酚蓝染色液：0.1%联苯胺样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液40%蔗糖溶液四、操作步骤凝胶制备聚丙烯酰胺凝胶配方成分含量作用A液（30%Acr-0.8%Bis）2.65mL交联剂B液（Tris+EDTA）4.75mL缓冲液C液（TEMED）10μL加速剂D液（10%AP）50μL催化剂四、操作步骤样品制备称取小麦幼苗叶片0.5克，放入研钵内，加pH8.0样品提取液1mL，于冰浴中研成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以8000rpm离心10分钟，倒出上清液，以等量40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝，即为样品液。四、操作步骤装槽、上样30-50μL四、操作步骤电泳接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行至距胶板末端1-2厘米处，即可停止电泳。四、操作步骤剥胶、染色电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地将凝胶置于染色盒中，进行染色反应，染色10min，用蒸馏水漂洗1-2次。五、结果与分析结果分析过氧化物同工酶的种类及活力大小电泳图或模式图实验注意事项心得收获六、讨论与心得