实验八 凝胶过滤法分离蛋白质

一．目的要求：学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。二．原理当不同大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时:比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。Sephadex按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。SephadexG-10，15，25，50，75，100，150，200数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。SephadexG-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。常用Sephadex分离范围琼脂糖三、器材与试剂1×20cm层析柱、葡聚糖凝胶Sephadex-50、蒸馏水、三角铁架、4mg/ml蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液。四、实验操作1、凝胶溶胀取SephadexG-5015g，加500ml蒸馏水室温溶胀一天（或沸水浴中溶胀1小时）。待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至无细颗粒为止。实验操作2、装柱取1×20cm层析柱一根，底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱下过滤层的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占层析柱内部总体积的1/3时，关闭下端出口。自顶部缓缓加入Sephadex-50悬液，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，凝胶加至离层析柱顶部约3cm即可。用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水面)。在装柱过程中，凝胶柱内若有气泡和分离断层现象时，可用玻棒搅动消除这些现象或重新装柱，装柱结束后其凝胶表面应平整实验操作3、加样：取4mg/ml蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混合，即为上柱样品。将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面。打开出口，让样品进入床内，直至样品全部进Sephadex凝胶柱，关紧出口。滴加蒸馏水使之成2cm水柱。不要使平整的床表面搅动实验操作4、洗脱和收集调节蠕动泵流速，使得进水速度0.3ml/min。打开出口，让柱内液体缓慢流出,流速0.3ml/min，取小试管20支，每管收集1ml，观察两种颜色出现的管号。不能让凝胶表面露出水面实验操作5、绘制洗脱曲线。五、注意事项接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。六、思考题根据实验中遇到的各种问题，总结做好本实验的经验与教训，完成实验报告。比较几种蛋白质分离方法的特点附录：HPLC高压液相色谱附录：凝胶过滤常用填料1：葡聚糖凝胶（Polydextran），商品名称是Sephadex2：聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）3：琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶（Sephadex）Sephadex不溶于溶剂，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中稳定。Sephadex的分离范围与填料粒经和交联度密切相关。Superdex属于葡聚糖以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的球形凝胶，流速快、反压低。聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）Polyacrylamide合成凝胶，商品名Bio-GelP，干粉颗粒状。化学性质不活泼，极端的pH会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此pH值应尽量控制在2-10之间。P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。琼脂糖凝胶Agarosegel是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质。颗粒软，50度以上会融化，需低温的环境中进行层析。Agarose做成beads后不能再脱水干燥，所以湿态中保存。商品名Sepharose，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose2B，4B和6B。经2，3－二溴丙醇反应交联而成的凝胶为SepharoseCL型凝胶。Sepharose型号型号粒度（微米）有效分离范围（球形蛋白质）Sepharose2B70000－40000000Sepharose4B60000－20000000Sepharose6B10000－4000000SepharoseCL-2B70000－40000000SepharoseCL-4B60000－20000000SepharoseCL-6B10000－4000000Superpose琼脂糖经多次交联形成的凝胶。型号粒度（微米）有效分离范围（球形蛋白质）Superose65000－5000000Superose121000－300000