33微生物的培养与应用

专题2微生物的培养与应用一、微生物的实验室培养（一）培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质称培养基一般的培养基均需要碳源、氮源、无机盐和水等（具体见教材15页“100mL牛肉蛋白胨培养基的营养构成”）。培养基的基本成分培养基的种类（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。（二）无菌技术无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法技术。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术就是防止杂菌污染的操作技术。消毒无菌技术的种类灭菌使用较为温和的方法（酒精、紫外线）来杀死部分对人体有害的微生物。对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁消毒；将培养皿、接种用具进行灭菌；接种的过程要在酒精灯附近进行。使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒……(1)消毒的方法：1.灼烧灭菌：接种用具和接种过程中的试管口或瓶口放在酒精灯火焰的充分燃烧层中进行灼烧灭菌（如教材16页图2-2所示）。（2）常用的灭菌方法2.干热灭菌：将玻璃器皿、金属用具等能耐高温并需要保持干燥的物品放到干热灭菌箱内，在160～170OC中加热1～2h即可。3.高压蒸汽灭菌：将需灭菌的物品放到盛有水的高压灭菌锅内（见教材16页图2-4）煮沸，待冷空气排尽后，密闭继续加热至锅内压力到100kPa，温度到121OC后，维持15～30min即可。二、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.牛肉膏蛋白胨固体培养基配方物质牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水重量5g10g5g20g定容至1000mL2.称量按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。3.溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加蒸馏水定溶至100mL。4.灭菌(先调PH)将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），放到高压锅内灭菌；培养皿（用几层报纸包好）放入干热灭菌箱内灭菌。5.倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板（如教材17图示）。倒平板操作的讨论1.培养基灭菌后要冷却到50OC时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。（二）纯化大肠杆菌微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。1.平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（操作如教材18页图示）。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。1、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。系列稀释操作101102103104105106(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管。涂布平板操作(1)将涂布器浸在盛有70％的酒精的烧杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培养基表面。(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却8～10s。(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布平板操作讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。三、结果分析与评价1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似？未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。四、课题延伸—菌种的保存1.试管低温临时保存将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔3～6个月要重新接种培养后再保存）。2.甘油管长期保存在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高压灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的冷冻箱中保存。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（一）筛选菌株原理人为提供有利于目的菌株的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？碳源是葡萄糖，氮源是尿素。2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用？如果有，又是如何进行筛选的？能分解尿素的细菌的筛选有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。（二）统计菌落数目原理运用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。（三）设置对照A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种，看是否有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。所以，在实验中一般都应设置对照组，使实验更有说服力。阅读教材22～23页“（三）设置对照”一段，并讨论教材中提出的问题。1.实验名称土壤中某样品细菌的分离与计数2.实验目的（略）3.材料用具（略）4.操作步骤从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去（铲已经过消毒处理）表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先灭菌过的信封中。（1）土壤取样一、实验设计将菌液稀释（见教材23页“样品稀释流程示意图”）。稀释倍数为101～106。每个稀释度均用3个选择培养基。（2）样品稀释涂布（3）微生物的培养与观察将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生，做好记录。（4）细菌的计数选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。二、结果分析与评价1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。2.样品的稀释操作是否成功如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。3.重复组的结果是否一致如果各位同学选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操作过程中去分析、寻找可能的原因。三、课题延伸能分解尿素的细菌的鉴定鉴定的原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基的pH升高。鉴定方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基的颜色变化。分解纤维素的微生物的分离（一）纤维素与纤维素酶纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。纤维素C1酶Cx酶纤维二糖葡萄糖苷酶葡萄糖刚果红染色法刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。（二）纤维素分解菌的筛选用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时，可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚果红染成红色的纤维素分解了。一、实验设计请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布在鉴别纤维素分解菌的培养基上筛选产生透明圈的菌落土壤中纤维素分解菌的分离1.土样采集：土样采集的方法与本专题课题2类似。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。二、实验案例2.选择培养：选择培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊，重复上述方法再培养一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。目的：增加纤维素分解菌的浓度阅读与思考阅读教材28～29页“资料一”～“资料三”，并思考相关问题。问题一：是液体培养基，因为没有添加琼脂。问题二：具有筛选作用，因为培养基中的碳源是纤维素，该培养基只有能分泌纤维素酶的纤维素分解菌才能生长。问题三：用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照，或者将纤维素粉换成葡萄糖；选择培养基具有筛选、纯化微生物的作用。3.刚果红染色法分离：常用的刚果红染色法有两种，一种是