8 抗体酶、核酶和极端酶

抗体酶核酶极端酶AbzymeRibozymeextremozyme第一节抗体酶（Abzyme)一、抗体酶的理论基础1.抗体蛋白的特性：抗体（antibody）：抗原（antigen）：半抗原（hapten）：IgG的三级结构IgG与抗原形成的交联晶格抗体与酶的异同：相同点：都是蛋白质，都有特异性。不同点：1）抗体无催化活力，酶有催化活力。2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。3）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。2.酶与底物形成过渡态理论酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。二、抗体酶的定义抗体酶又称催化抗体（catalyticantibody），是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。三、抗体酶的制备1.诱导法用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。2.拷贝法用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶.3引入法将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术引入法举例四、抗体酶的应用1.戒毒:用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。2.肿瘤治疗抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。抗体酶的催化反应1．酰基转移反应2．重排反应3．氧化还原反应5．磷酸酯水解反应6．磷酸酯闭环反应7.光诱导反应a.光聚合反应（二聚作用）b.光裂解反应研究展望1．研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系的一般规律。2．获得一类新型的蛋白酶。3．催化天然酶不能催化的反应。第二节核酶（Ribozyme)一、核酶的概念二、核酶的种类三、核酶的应用四、核酶面临的问题五、影响核酶活性的因素ribozyme的发现80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的ThomasCech和美国耶鲁大学的SidneryAltman各自独立地发现RNA具有生物催化功能.从而改变了生物催比剂的传统概念。为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶enzyme极端酶extremozyme抗体酶abzyme生物工程酶其它：模拟酶核酸类:克隆酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶、RibozymeDeoxyribozymeI型内含子剪接型核酶II型内含子锤头核酶剪切型核酶发夹核酶自体催化丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP异体催化二、核酶的分类自然界存在催化分子内反应（incis）的ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化分子间反应(intrans)的ribozyme。自我剪接ribozyme分类自我剪接ribozyme可分为两类：Ⅰ型IVS：均与四膜虫大核rRNA前体的IVS结构相似、催化自我剪接需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。Ⅱ型IVS：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的IVS相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+2．自我剪切ribozyme的分类自我剪切ribozyme,自我剪切的RNA结构有锤头结构和发夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。自我剪接ribozyme：包含剪切与连接两个步骤。几种能进行自我剪切的RNA结构催化分子间反应的ribozyme的分类如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多种分子间反应。1.剪接型核酶剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（Intron)。1）I类内含子的自我剪接(Self-splicing)I型IVS是与四膜虫26srRNA前体的IVS结构相似的间隔序列，具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA及G-IVS，G-IVS经两次环化生成L-19IVS。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。剪接机制L-19IVS在体外的多种酶活性p3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HOⅠ类内含子的剪接机制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外显子内含子或居间序列（Interveningsequence,IVS)5‘UpAGpU5'3'5'外显子3'外显子内含子pG-OHpGpAGpU3'U5'OH第一次转酯反应第二次转酯反应U5'pU3'pGpAGOH5'3'UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCUAAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜虫rRNA前体自我剪接反应1、转核苷酸作用2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用CpCpCpCpCpCpCpCpCpC+Pi5、限制性内切酶作用CpUpCpUpN+GCpUpCpU+GpN2）Ⅱ类内含子的自我剪接Ⅱ型IVS是与细胞核mRNA前体的IVS结构相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应，生成成熟的RNA及套环状的IVS。催化的剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子(Mg2+)。剪接机制p2‘HO-App-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ类内含子的剪接机制Mg2+套环的形成5‘3‘外显子连接2.剪切型核酶这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。1）自体催化剪切型剪切机制转酯化过程：由靠近切割位点3‘端的2’OH或氧原子对切割位点的磷原子实施亲核攻击，产生5‘-OH和2’，3‘-环磷酸二酯。剪切机制核酶自身剪切反应锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图•三个双螺旋区。•13个核苷酸残基保守序列。•剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生。发夹（hairpin）结构1989年汉普（Hample）研究烟草环斑病毒（sTRSV）的负链RNA的自我剪切反应，提出发夹结构（hairpinstructure）模型。发夹核酶结构模型•四个螺旋区、三个连接区和两个环。•剪切反应发生在底物识别序列GUC的5‘端。5‘3‘发夹二级结构模型剪切位点2)异体催化剪切型核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH和5’-磷酸末端。RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。三、核酶的应用1.基础理论：生命起源的探索2.医药：1）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)、抗肿瘤。2）免疫原性低，很少引起免疫反应。3.植物抗病毒四、核酶面临的问题1、核酶催化效率低。2、核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶RNase破坏。五、影响核酶活性的因素1、pH值对活性的影响：pH7.0-7.5时核酶活性最高。2、二价金属阳离子对活性的影响:Mg2+Mn2+3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应4、变性剂对活性的影响:5、温度对活性的影响:Ribozyme研究进展与展望对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得分子更小的、高效的ribozyme研究热点：从催化分子内反应的自我剪切ribozyme设计出催化分子间反应的ribozyme.Ribozyme的固定化Ribozyme的固定化已成功，将在医学、工业上获得应用。意义：对各种RNA-蛋白质复合物酶的分离鉴定，对许多具有特别重要生物功能的RNA和蛋白质构成的颗粒体。在自然界将会发现更多的具有自我剪接或自我剪切的RNA分子和以非RNA为底物的ribozyme第三节极端酶（extremozyme）一、极端微生物和极端酶1.极端微生物：又称嗜极菌（extremophiles），是在超常生态环境条件下生存的微生物。根据所耐受的环境条件不同，分为：嗜热菌（thermophiles）超嗜热菌（hyperthermophiles）嗜冷菌（psychrophiles）嗜盐菌（halophiles）嗜酸菌（acidophiles）嗜碱菌（alkaliphiles）嗜压菌（barophiles）抗辐射的微生物2.极端酶的制备1）天然极端酶的筛选和生产2）蛋白质工程生产极端酶思考题：