63细胞培养技术

细胞培养技术赵培荣郑州大学肿瘤中心一、体外培养的定义••在体外模拟一个体内的微环境，使离•体的器官、组织、细胞在体外存活。可用•于药物的筛选、细胞周期、细胞代谢、细•胞分化的研究。••体外培养包括：器官培养、组织培养、•细胞培养。二、细胞培养技术的优点•1、便于应用各种物理、化学和生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的规律。•2、便于应用各种不同的技术方法研究和观察细胞结构和功能的变化。•3、可长期研究和观察细胞的遗传行为的改变。•4、可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究的对象，耗费少，比较经济。三、细胞的类型•贴壁型（贴附型）细胞••悬浮型细胞（一）、贴壁型细胞•这类细胞在培养时能贴附在支持物上生，绝大多数细胞培养时，皆呈贴壁型，细胞帖附生长后，常失去原有的形态，出现类似“返祖”现象。•分类：成纤维细胞型；•上皮细胞型；•游走细胞型；•多形性细胞型；1、成纤维细胞型•形态：与成纤维细胞相似。•胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆形核，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起。细胞群常借原生质突起连接成网。生长时呈放射状。•凡由中胚层间充质来源的其他组织细胞，如血管内皮、心肌、平滑肌、成骨细胞等，也多呈成纤维细胞形态。但无分泌纤维的能力，只是一种习惯上概括的称法而已。2、上皮细胞型•形态：本型细胞呈扁平的不规则多角形，中央有圆形的核，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片。•起源于外胚层和内胚层的组织细胞，如皮肤表皮及衍生物（汗腺和皮脂腺等）、肠管上皮、肝、胰和肺泡上皮细胞培养时，皆呈上皮型。3、游走细胞型•在支持物上散在生长，一般不连接成片，•细胞胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的•游走和变形运动。速度快而且方向不规•则。此型细胞不稳定，难与其它型细胞相•区别。4、多形性细胞型•如神经组织的细胞。难以确定它们的稳定形态。••以上划分，主要是根据细胞的一般形态特征和描述上的方便，但实际上，环境改变，形态也会改变。如HELA细胞（人宫颈癌细胞），本属上皮细胞型，但在过酸或过碱的培养液中，可变成长梭形，在适宜的PH值时细胞又可复原。（二）、悬浮型细胞•细胞在培养时不贴附于支持物上，而是悬•浮状态生长。如某些肿瘤细胞和血液白细•胞既呈悬浮型。细胞体呈圆形。四、细胞的形态结构•呈悬浮状态生长时，不论原来属于哪种类型•的细胞，由于存在液体环境中，胞体回缩，•基本呈圆形。如附于支持物表面之后，开始•仍为圆形，但为时很短。经过形态过渡，恢•复成原细胞形态。细胞形态过渡的过程•一般附于支持物上数分钟后，既由球形移•行成圆饼形，有人把这种状态的细胞称为•发射延展细胞，过一段时间后，延展细胞•过渡为极性细胞。成纤维细胞不经放射延•展。而上皮细胞经过延展细胞后进入极性•细胞时，细胞相互连接成一片。五、细胞周期•细胞分裂间期：G1期、S期、G2期。•细胞分裂期：前期、中期、后期、末期。••按5×104~2×105个/ml细胞接种，到在支持物上生长满，从一瓶细胞分成两瓶细胞，叫传代。一般习惯上称做一代，但实际上细胞能增殖6-7代。六、细胞的生物特性•1、正常的细胞离体培养后，可维持2倍体性质，但在一般情况下，2倍体细胞只能传30-50代，生长一年左右，以后停止生长、衰老死亡。•2、肿瘤细胞则可生长时间长，获得无限的生长能力。•3、胰酶可使细胞衣性质改变，使细胞易从支持物上脱离下来。七、细胞生存条件和代谢•（一）温度：36-38℃通常为37℃。•细胞对低温度的耐受力比对高温的耐受力强。•45℃——1小时死亡。•41-42℃——10-24小时死亡。•25-35℃——长时间不死亡。•4℃——数小时后37℃仍能存活。•-196℃——长期保存。（二）、气体和氢离子浓度•主要有O2和CO2。•O2参与三羧循环，产能供细胞所有。有些无氧时也能存活，但大多数不能生存。CO2既代谢的产物，也是细胞生存的所需气体。它主要维持培养基的PH值，PH7.2-7.4最适宜。低于6.8或高于7.6，对细胞不利。但不同的细胞对PH要求也不同。总之偏酸环境比偏碱环境更利于细胞生长。•处代培养和细胞数少时对PH变动耐受力差。CO2高或CO2低对细胞都不利，保持CO2恒定的浓度（5%）即可维持培养基中氢离子浓度。•密闭瓶口的培养方法，随CO2浓度的升高，PH不断变化。•开放的瓶皿中培养，能保持氢离子的浓度，有利于细胞生长。（三）、基本营养物质•与体内相同的三大物质：•蛋白质、脂肪、糖。•培养基；•血清；八、细胞的死亡•细胞在培养过程中，常见的死亡现象有：•群体死亡：因素衰老、污染、缺乏营养、•PH值、温度。•个体死亡：可能由于不适应性淘汰和异常•细胞分裂引起。•在接种和传代之前死亡，细胞不贴壁。•生长过程中死亡，胞体变圆形，细胞间隙增大，形态轮廓明显，整个细胞可能崩溃成数块，最后液化失望。实验室操作一、清洗•酸液的配置：次强酸•120g重铬酸钾•200ml浓硫酸•1000ml水•配制时，先将重铬酸钾溶于水，再将浓硫酸缓慢加入，注意过急易产热发生危险。应边加入边搅拌，或在下面放一盆冷水，使溶液冷却。酸液一般为棕红色，水分增多或变成绿色，表明失效。不能与电泳、免疫组化公用。•浸泡时，将水分空干或干燥，使器皿充满酸液，勿留气泡，浸泡24小时。玻璃器皿的清洗步骤•1、培养后器皿立即用自来水浸泡过夜。•新使用的器皿用5%的稀盐酸浸泡过夜或•煮沸30分钟。•2、用毛刷和洗涤剂刷洗，注意边角。•3、自来水冲洗干净、凉干‘•4、酸液浸泡过夜。•5、自来水冲洗若干遍至干净。•6、蒸馏水漂洗三遍。凉干或烤干备用。塑料器皿的清洗•先用清水充分浸泡和冲洗，再用2%NaOH•溶液浸泡过夜，自来水冲洗。然后用5%的•HCL浸泡30分钟，自来水冲洗，最后用蒸•馏水洗三遍。凉干或烤干后备用。瓶塞的清洗•每次用过用自来水浸泡，然后用2%NaOH•煮10-20分钟，自来水冲洗，再用1%HCL•浸泡30分钟。最后自来水冲洗，蒸馏水洗•三遍。晾干备用。滤器的清洗•1、玻璃滤器的清洗：清洗用抽滤法。•使用后，立即用清水注入滤器抽滤5次。•干净酸液抽滤1次。•再用清水抽滤10次。•蒸馏水抽滤3次。备用。蔡氏滤器的清洗••使用后，金属部分刷洗干净，最后用蒸馏水洗3遍，干后备用。金属器械的消毒••用自来水洗，蒸馏水洗净，酒精擦干备用。包装•消毒前要进行包装，以防消毒后二次污染。可用纱布、牛皮纸和棉花。•不能用报纸和污染的纸。•线绳打活结，便于使用。也可直接用饭盒包装。二、消毒•物理灭菌法：•1、紫外线：照射30分钟，可达灭菌效果。•优点：方便、效果好。•缺点：产生臭氧，污染空气。•2、干热消毒法：仅用于玻璃器皿。•160℃保持90-120分钟。•注意：消毒后不要立即打开箱门，以防冷空气进入，影响消毒效果和损坏器皿。3、湿热消毒•所有物品均可用。消毒时，箱体内不能•装的过满。上气后20分钟。通常120℃、•15磅。4、过滤消毒•用0.22u的微孔滤膜，速度不要太快，过滤后要分装。化学消毒•消毒剂：1‰新洁而灭；•75%酒精；培养用液的配制•要求：1、配置浓度要准确；•2、都要标注日期、浓度、PH、名•称、消毒于否。•3、存放地点固定。•对水的要求：三蒸水、去离子水；•贮存时间不能超过两周，最•好是新鲜的。胰酶溶液的配制•浓度0.25%-0.125%PH6.8-7.2左右。•方法：1、用少量D-Hanks液先将胰酶调成•糊状。•2、补充D-Hanks液，摇匀、4℃过•夜。•3、次日溶解后，用滤纸滤。•4、无菌过滤。•5、分装，-20℃保存。•用时用调PH至7.0。EDTA溶液的配制•浓度0.02%用D-Hanks液溶解后，湿热消•毒。分装4℃保存。8%NaHCO3的配制•三蒸水配置，湿热消毒。分装4℃保存。青-链霉素溶液的配制•青霉素100万单位/50mlD-Hanks液•链霉素100微克/50mlD-Hanks液•培养液中终浓度为：青霉素100单位/ml••链霉素100微克/ml