实验一 细菌基因组DNA的提取

实验一细菌基因组DNA的提取一、实验原理1、核酸的分类DNA主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。核酸纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。2、核酸制备的一般原则一、实验原理核酸制备时应注意的事项:①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。②减少化学因素对核酸的降解。③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温④防止核酸的生物降解。3、核酸制备的一般原则一、实验原理核酸制备的步骤：破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。4、核酸制备的一般方法和原理一、实验原理核酸酶的抑制和抑制剂DNase抑制①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。核酸酶的抑制和抑制剂RNase抑制①操作要带手套。②所有器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠核酸制备中常用的蛋白质变性剂蛋白质变性剂的作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC核酸制备中常用的酶DNaseRNase蛋白酶K溶菌酶核酸提取的一般过程1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂核酸提取的一般过程2）破碎抽提核酸除去杂质1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离2．使核酸与蛋白质分离3．除去脂类4．多糖的除去核酸提取的一般过程3）核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。4）核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4℃（5℃）最佳和最简单-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0二、材料、设备及试剂菌种：DBT降解菌设备：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，涡旋振荡器试剂：LB液体培养基、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5MNaCl、Tris-饱和酚、氯仿、RNA酶A、无水乙醇1、1.5ml菌液（每组两管）4℃12000rpm离心30sec，弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。2、每管加入400µl裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅助裂解，37℃水浴30min。3、每管加入132µl的5MNaCl溶液，颠倒试管，充分混匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪头（用剪刀剪去1ml枪头的尖端）小心取出上清液转倒两支新的eppendorf管中。4、加入等体积的饱和苯酚，充分混匀后，12000rpm离心3min，离心后的水层如混浊则说明仍含有蛋白质，则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤直到水层透明，水层和酚层之间不再白色沉淀物为止（约2次）。三、操作步骤5、将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积的氯仿，混匀后13000rpm离心3min，除去苯酚。6、小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积的无水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30min，然后13000rpm离心15min，可见白色丝状沉淀物。7、小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400µl70％乙醇洗涤2次，室温干燥后，用50µlTE（含20µg/ml的Rnase）溶解DNA，－20℃冰箱放置备用。四、注意事项——材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集四、注意事项——细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：•植物材料－－液氮研磨•动物组织－－匀浆或液氮研磨•组培细胞－－蛋白酶K•细菌－－溶菌酶破壁•酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡四、注意事项——核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法四、注意事项——核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解•TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase•pH值为8.0，可防止DNA发生酸解1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）五、DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因对策1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题二：DNA降解对策原因五、DNA提取常见问题1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少对策原因五、DNA提取常见问题1．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。2.沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇？基因工程教学网站：六、问题与讨论