第四章 目的基因的获得-酵母双杂交

酵母双杂交系统酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。一、酵母双杂交系统简介它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。经典文献出处FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340(6230):245-246二、酵母双杂交系统的建立该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：转录激活因子DNA结合结构域(BD)(DNAbindingdomain)转录激活结构域(AD)(activationdomain)1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)。这两个结构域各具功能，互不影响，单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA系统和Gal4系统两种。在LexA系统中，DNA结合域由一个完整的原核蛋白LexA构成，转录激活域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录;在Gal4系统中，BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。两个结构域中的BD由位于N-末端的1～147位多肽构成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列(upstreamactivationsequence，UAS)。此外，在其N-端还具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768～881位多肽构成。Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以相互作用的。当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近,形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS，并可与之结合；Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活UAS下游报告基因LacZ的转录。三、酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BD许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。1.结构域（Domain）合作例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNAbindingdomainActivedomainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（UAS）转录激活GAL4效应基因结合结合激活转录实验发现：转录表达只要DNAbindingdomain（DNA-BD）与Activedomain（AD）靠近就能激活转录。2.拆开DomainDNAbindingdomainActivedomain上游激活序列（UAS）转录激活GAL4效应基因结合用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。不能转录3.重组Domain用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接。Activedomain蛋白A蛋白BDNAbindingdomain在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。4.观察报告基因表达GAL4的BDdomain与ADDomain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。（1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合上游激活序列（UAS）转录激活GAL4效应基因蛋白ADNAbindingdomain转录激活domain蛋白B激活转录转录表达X基因和Y基因产物的相互结合，导致reportergene表达。Reportergene表达就说明X基因产物与Y基因产物能结合。双杂交原理酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:易于转化、便于回收扩增质粒具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相互结合报道株经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞基因组中GAL4基因是缺失型的基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、HIS改造后的酵母细胞的特点：通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落表达“诱饵”和“猎物”蛋白；检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物”蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。四、酵母双杂交系统的基本策略五、酵母双杂交系统的优点1.高敏感性。原因：①采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；②激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；③通过mRNA使信号放大；④检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。五、酵母双杂交系统的优点2.真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。3.简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。4.广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。分析已知蛋白之间的相互作用对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。绘制蛋白质相互作用系统图谱在药物设计中的应用六、酵母双杂交系统的应用现状1.利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质的新功能将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原和抗体之间的相互作用，但它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。2.利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用3.利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。4.利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列。利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。七、酵母双杂交系统中常见问题的解决和改进措施（一）假阳性较多（二）转化效率偏低（三）阴性干扰假阳性定义：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。（一）假阳性较多①BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。②如AD融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。③AD融合蛋白直接与转录因子作用激活报告基因；④AD融合靶蛋白与BD相互作用或者AD与BD融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。原因：排除假阳性的措施①作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。②采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。目前试剂公司已采用。③报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。④优化3-AT(3-aminotriazole，3-氨基三唑)浓度。适当增加浓度可减少假阳性。进一步分析：①这种相互作用是否会在细胞内自然发生。②有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用。③一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白也可发生相互作用。排除假阳性的措施原因：由于酵母转化效率较细菌低4个数量级，因此转化成为双杂交技术的重要瓶颈。解决办法：引进酵母接合型a接合型和接合型（两者之间可形成二倍体，但自身不能）（二）转化效率偏低接合型酵母细胞cDNA文库诱铒蛋白基因多克隆位点DNA-BD载体AD载体转化转化a接合型酵母细胞筛选平板生长菌苔筛选平板生长菌苔同一个三重筛选平板克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）鉴定β-半乳糖苷酶部分已商品化（三）阴性干扰融合蛋白的表达对细胞有毒性，该怎么办？应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。原因：酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。八、酵母双杂交系统使用注意事项酵母双杂交系统局限性1.某些诱饵蛋白具有自身激活性质。---------双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域2.某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。酵母双杂交系统局限性3.有时DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。4.哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究。双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。在酵母双杂交的基础上，又发展：•酵母单杂交--用于核酸和文库蛋白之间的研究•酵母三杂交--三种不同蛋白之间的互作研究•酵母的反向杂交--两种蛋白相互作用的结构和位点。反向双杂交系统和三杂交技术(一)酵母单杂交系统(one-hybridsystem)1993年，由Wang和Reed等相继创立发展出一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系。WangMM,ReedRR.MolecularcloningoftheolfactoryneuronaltranscriptionfactorOlf-1bygeneticselectioninyeast.Nature，1993，364(6433):121-126.文献出处酵母