流式的原理及应用概要

流式的原理及应用杜欣康BD生物科学，流式细胞仪技术支持电话：[phone]邮箱：[e-mail]2什么是流式细胞术3什么是流式细胞术•流式细胞术（FlowCytometry）是指利用流式细胞仪，通过检测细胞上/内特异标记的荧光信号，从而测定细胞的多种生化特性（表面受体、抗原、离子、DNA/RNA等的表达）的方法。4流式细胞术的特点5流式细胞术的特点•分析对象：任何直径50μm的颗粒，一般为单细胞悬液6流式细胞术的特点•分析对象：任何直径50μm的颗粒，一般为单细胞悬液•分析速度：快速，Calibur2,000事件/秒7流式细胞术的特点•分析对象：任何直径50μm的颗粒，一般为单细胞悬液•分析速度：快速，Calibur2,000事件/秒•检测参数：多个（两个散射光，多个荧光参数）8流式细胞术的特点•分析对象：任何直径50μm的颗粒，一般为单细胞悬液•分析速度：快速，Calibur2,000事件/秒•检测参数：多个（两个散射光，多个荧光参数）•检测结果：精度高，准确性好，具有统计学意义9BD公司的分析型流式细胞仪10BD公司的分选型流式细胞仪11流式细胞仪的结构12流式细胞仪的结构•液流系统–收集细胞并使之与激光正交13流式细胞仪的结构•液流系统–收集细胞并使之与激光正交•光学系统–激发和收集光信号14流式细胞仪的结构•液流系统–收集细胞并使之与激光正交•光学系统–激发和收集光信号•电子系统–把光信号按比例转化成电子信号15流式细胞仪的结构液流系统废液桶鞘液桶上样针流动室激光正交16流式细胞仪的结构液流样本样本鞘液鞘液鞘液鞘液红激光蓝激光紫激光低流速高流速17流式细胞仪的结构•流速：–低速12μl/min–中速35μl/min–高速60μl/min18流式细胞仪的结构光学系统19流式细胞仪的结构长通接收器带通长通+带通20流式细胞仪的结构21流式细胞仪的结构LaserWavelengthMin.PowerCommonlyUsedFluorochromes(nm)(mW)orDyesBlue488nm13FITC,PerCP,PerCP-Cy5.5Red633nm11APC,APC-Cy7,APC-H7Violet405nm30PacificBlue™,DAPI,BDHorizonV450andV500NearUV375nm7HoechstRed,HoechstBlue,PI,DAPIYellow-Green561nm30PE,PE-Cy5.5,PE-Cy5,PE-TexasRed®,mCherry,PE-Cy7,PIBlue-Violet445nm20CFP,AmCyanfluorescentprotein22流式细胞仪的结构23流式细胞仪的结构电子系统光子接收器光信号转化为电信号电信号处理电脑24流式细胞仪的结构电子系统25流式细胞仪的结构•高（H）=最大荧光强度•宽（W）=时间•面积（A）=总荧光强度26流式细胞仪的结构27流式细胞仪的结构28流式细胞仪的结构29流式细胞仪的结构30流式细胞仪的结构31流式细胞仪操作的基本流程32流式细胞仪操作的基本流程开机和液流启动质控样本收集数据分析样本收集数据分析清洗和关机33流式分析样本的制备34流式分析样本的制备35流式分析样本的制备•单细胞悬液的制备•目的分子的标记•样本过滤等待上机36流式分析样本的制备37流式分析样本的制备38流式分析样本的制备39流式分析样本的制备40流式分析样本的制备41流式分析样本的制备42流式分析样本的制备43流式常见的实验44流式常见的实验•荧光免疫–直接染色vs间接染色–强荧光配弱表达，强表达配弱荧光–染料数量不大时可以避免使用临近通道–通道间的溢漏（补偿）45流式常见的实验•荧光免疫–强荧光配弱表达–强表达配弱荧光46流式常见的实验•荧光免疫–什么是溢光？为什么要补偿？47流式常见的实验48流式常见的实验•荧光免疫–为什么要做同型对照和单阳管？49流式常见的实验•荧光免疫（实例）–CD4FITC,CD8PE,CD3APC染色•同型对照：PB100μL+IsotopeFITC20μL+IsotopePE20μL+IsotopeAPC5μL•单阳管：PB100μL+CD4FITC20μL+IsotopePE20μL+IsotopeAPC5μL•单阳管：PB100μL+IsotopeFITC20μL+CD8PE20μL+IsotopeAPC5μL•单阳管：PB100μL+IsotopeFITC20μL+IsotopePE20μL+CD3APC5μL•样品管：PB100μL+CD4FITC20μL+CD8PE20μL+CD3APC5μL50流式常见的实验51流式常见的实验•细胞周期52流式常见的实验•细胞周期53流式常见的实验•细胞凋亡54流式常见的实验•细胞凋亡