RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳原理与结果

RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳原理与技术RT-PCR（reversetranscriptional-PCR）RT-PCR原理DNA聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增RT-PCR主要用途检测特异基因的表达量特异基因的组织定位构建cDNA文库鉴定已转录序列是否发生突变RT-PCR反应体系10×buffer2ulMg2+4uldNTP2ulRnaseInhibitor0.4ulAMVRnaseXL0.4ulAMV-Taq0.4ulH2O3.8ul引物Ⅰ1ul引物Ⅱ1ulRNA(≤1ug)5ul一步法RT-PCRRT-PCR反应体系ComponentsVolume(µl)RNA8(1µg)5xR.T.buffer4dNTPs(10mmol/L)2Primer1Rnasin(50U/µl)0.4AMV-RT((10U/µl)1.0DEPC-H2O3.6Total20两步法RT-PCRComponentsVolume(µlR.T.Product5.010xPCRbuffer2.5MgCl2(25mmol/L)2.5Primer11Primer21TaqDNApolymerase1ddH2O12Total25cDNAPCR扩增cDNA第一链合成反应实验目的了解RT-PCR的基本原理。熟悉RT-PCR的常规步骤。掌握琼脂糖凝胶电泳技术。实验要求掌握PCR技术。学会操作PCR仪。熟悉琼脂糖凝胶电泳技术。实验原理聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。实验原理PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。在DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，用两段寡核苷酸作为反应的引物。一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补；而这两段模板序列又分别位于待扩增DNA区段的两侧。反应时，首先是在摩尔数过量的两段寡核苷酸及4种dNTP存在下，将模板进行加热变性。随之将反应混合物冷却至某一温度，使引物与它的靶序列进行配对，称为退火。然后，退火引物可在DNA聚合酶作用下进行延伸。上述过程是由温度控制的。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。实验原理PCR是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR按照底物（即模板DNA）的来源和引物的特点可分为经典PCR、逆转录PCR（RT-PCR）和免疫PCR（IM-PCR）。其中，RT-PCR较常用。在这个反应体系中，被检物为RNA，如mRNA，需借助逆转录酶的逆转录作用，转变为相应的互补链DNA（cDNA）才能进行PCR。为此，逆转录和PCR分两步进行，先作逆转录获得cDNA，再以此为模板作PCR。RT-PCR的准备--试剂提取细胞或组织中RNA购买RT-PCR试剂盒（一步法或两步法）RT-PCR的准备--耗材、仪器超净台PCR仪移液器吸头200ulPCR管EP管架枪头盒PCR板冰盒RT-PCR过程中cDNA第一链合成反应所用的枪头、枪头盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后使用。玻璃制品在180℃干烤6-8小时。加样过程在超净台内进行，需戴手套与口罩。cDNAPCR扩增的准备工作同普通PCR反应。RT-PCR反应程序(1)42℃30min，(2)94℃3min，(3)94℃变性3min，(4)94℃变性30sec，(5)52℃退火30sec，(6)72℃延伸1min。(7)goto(4)repeat29,（8）72℃延伸10min。（9）holdat4℃。RT-PCR操作过程cDNA第一链合成反应所用枪头、枪头盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后使用。玻璃制品在180℃干烤6-8小时。在超净台内按试剂盒说明书进行加样，加样过程需戴手套与口罩。cDNAPCR扩增的准备工作同普通PCR反应。在PCR仪上设定程序进行反应。琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸片段的有效方法，琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，利用电荷效应，在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。利用分子筛效应可以分离不同片断大小和不同构象的DNA、RNA分子。琼脂糖凝胶电泳的主要用途分离不同片断大小和不同构象的DNA、RNA分子。鉴定DNA片段，如PCR产物的鉴定。纯化DNA分子。琼脂糖凝胶电泳的准备--试剂琼脂糖电泳缓冲液：Tris，冰乙酸，EDTA（TAE）6X载样缓冲液（Loadbuffer）：溴酚蓝，蔗糖染色液：goldviewDNA或RNA样品DNA分子量marker琼脂糖凝胶电泳的准备--仪器、耗材电泳仪电泳槽微波炉三角瓶移液器电子天平枪头凝胶成像系统琼脂糖凝胶电泳的操作过程1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入5μl的goldview，并摇匀。）装好制胶板，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。琼脂糖凝胶电泳的操作过程用移液器吸取PCR产物10μl于封口膜上，再加入2μl的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。打开电源开关，调节电压至50-100V，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。将凝胶置于凝胶成像系统，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。琼脂糖凝胶电泳的操作过程琼脂糖凝胶电泳的注意事项配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围