乙肝两对半定性测定

乙肝两对半测定－酶联免疫法实习生：廖於波指导老师：李海龙HBV是乙型病毒性肝炎的病原体。HBV感染呈世界性流行，但不同地区感染的流行程度差异很大。据WHO报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。我国属高流行地区一般地区HBsAg阳性率为7.18%。乙肝病毒血清标志物HBsAg第一个出现，感染后1-2周即可阳性阳性表示存在HBV感染HBsAb出现在HBsAg消失后保护性抗体疫苗免疫成功的标志乙肝病毒血清标志物HBeAg病毒复制标志传染性强HBeAb传染性降低长期存在是DNA与肝细胞整合的结果乙肝病毒血清标志物HBcAgHBV复制的标志血清中难以检测出来IgM-HBcAb急性HBV感染IgG-HBcAb急性感染恢复期和慢性持续感染检测HBV病毒血清标志物是临床最常用的病原学诊断方法。HBV具有三个抗原抗体系统，即乙肝表面抗原（HBSAg）和乙肝表面抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）和e抗体（HBeAb）、核心抗原（HBcAg）核心抗体（HBcAb），由于HBcAg在血液中难于检出，故临床免疫学检测不包括HBcAg，目前常采用酶联免疫法和化学发光法检测。酶联免疫吸附实验原理用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。乙肝病毒血清标志物检测原理血清学标志原理包被试剂标记或结合物结果判断HBsAg夹心法HBsAbHBsAb显色(+)HBsAb夹心法HBsAgHBsAg显色(+)HBeAg夹心法HBeAbHBeAb显色(+)HBeAb竞争法HBeAbHBeAb及中和抗原不显色(+)HBcAb竞争法HBcAgHBcAb不显色(+)标本本要求采集：血浆：使用抗凝血浆管（枸橼酸盐、EDTA盐、肝素之一为抗凝剂）采集样品。样品离心分离后，提取血浆用于检测。血清：采用正确医用技术采集标本。离心分离后，提取血清样品用于检测。标本要求储存：样品可存放于2~8℃冰箱，24小时内测定。若需长时间保存，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。上述样品使用前应恢复到室温，轻轻摇动混匀。若标本有沉淀物形成，应离心除去，并确定未变质方可使用。严重融血或脂血标本不可使用。试剂（安图生物）编号组分名称96人份1包被板69孔X1块2样品稀释液2.3mlX1瓶3酶结合物5.5mlX1瓶4底物液6.2mlX1瓶5显色剂6.2mlX1瓶6洗涤液30mlX1瓶7终止液5.5mlX1瓶8阴性对照1.0mlX1瓶9阳性对照1.0mlX1瓶10子母袋1个11说明书1份12板贴3张主要组成成分实验前准备1.取出试剂盒及待测样品，将所有试剂及样品恢复至室温（18~25℃）。2.将恒温箱或水浴锅调至反应温度。3.洗液用蒸馏水作20倍稀释后备用。检验步骤排板检验步骤表面抗原（两步法）1.留一孔作空白对照，加入样本稀释液20ul/孔（含空白孔），其他加入阴性对照三孔和阳性对照二孔100ul/孔及待测标本100ul/孔于相应的反应孔内。2.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该步骤非常重要）。3.贴上板贴，置37℃下温育60分钟。检验步骤4.撕下板贴，除空白孔外，各孔加入酶结合物50ul。5.在微型振荡器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该步骤非常重要）。6.贴上板贴，置37℃下温育30分钟。7.撕下板贴，洗板6次，最后在吸水纸上拍干。8.每孔加入底物液、显色剂各50ul，37℃避光温育30分钟。检验步骤9.加终止液50ul/孔，轻轻振荡混匀后，立即测试结果。10.使用酶标仪450nm单波长测量各孔的OD值。检验步骤表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体（一步法）1.留一孔空白，三孔加入阴性对照、二孔加入阳性对照各50ul/孔，其他各孔分别加入样本50ul(HBcAb测定时待测血清用生理盐水1:30稀释－50ul血清+1.5ml生理盐水)。2.除空白孔外，各孔加入酶结合物50ul。3.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该步骤非常重要）。4.贴上板贴，置37℃下温育30分钟。检验步骤5.撕下板贴，洗板6次，最后在吸水纸上拍干。6.每孔加入底物液、显色剂各50ul，37℃避光反应10分钟。7.加终止液50ul/孔，轻轻振荡混匀后，立即测试结果。8.使用酶标仪450nm单波长测量各孔的OD值。结果判定血清学标志原理包被试剂标记或结合物结果判断HBsAg夹心法HBsAbHBsAb显色(+)HBsAb夹心法HBsAgHBsAg显色(+)HBeAg夹心法HBeAbHBeAb显色(+)HBeAb竞争法HBeAbHBeAb及中和抗原不显色(+)HBcAb竞争法HBcAgHBcAb不显色(+)1.肉眼判定结果判定2.酶标仪判定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值，根据OD值判定结果注意事项浓缩洗涤液配制前充分摇匀。加样本时要加到孔底。加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体混匀。如果滴加，滴加前应弃去1-2滴。注意事项滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。勿将试剂滴在孔壁上。洗涤时各孔须加满，防止孔口内有游离酶残留。洗涤时注意孔与孔之间的交叉污染。脂血，溶血可影响结果。注意事项所有样本都应按传染源处理。样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关。任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗体存在。不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。影响检测结果的因素1.样本采集与处理的影响1.1标本严重溶血。1.2标本凝固不全：血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋原。2、试剂的影响2.1不同批号。2.2不同厂家。影响检测结果的因素3.操作技术的影响3.1加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。3.2温浴影响。3.3手洗条件一致性较差，对结果影响较大，半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果。常见模式及临床意义HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb临床意义+－+－+急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV复制，传染性强－大三阳+－－++急性HBV感染趋向恢复；慢性HBsAg携带者；传染性弱－小三阳+－－－+急性HBV感染；慢性HBsAg携带者；传染性弱+－－+－慢性HBsAg携带者易转阴；急性HBV感染趋向恢复+－+－－急性HBV感染早期或慢性携带者，传染性强+－－－－急性HBV感染早期；急性HBV感染潜伏期；慢性HBV携带者，传染性弱常见模式及临床意义HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb临床意义－++－+非典型性或亚临床型HBV感染－+－－－注射过乙肝疫苗有免疫力；既往感染；假阳性－+－++急性HBV感染后康复－+－+－HBV感染后已恢复－+－－+既往感染，仍有免疫力；HBV感染恢复期－－－－+既往感染未能测出HBsAb；恢复期HBsAg已消，HBsAb尚未出现；无症状HBsAg携带者－－－－－过去和现在未感染过HBV