2.微生物的分离培养

微生物的分离培养微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。常用的分离方法有稀释法、划线法、单细胞挑取法及利用选择培养基分离法等。1.稀释法1.0ml0.1ml稀释法2．平板划线分离法对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。划线分离方法注意事项：每画一组线，接种环需灭菌一次（即每个培养皿只取材料一次）划线操作划线分离的结果无菌操作指在操作过程中，防止任何其他微生物进入目标物体的方法。3．单细胞挑取法这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。4．利用选择培养基分离法不同微生物需要不同的营养物质、环境。对不同的化学试剂具有不同的抵抗能力。利用这些特性，便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择性培养基。将待分离的样品先进行适当处理，以消除不希望分离到的微生物。第2节微生物接种与培养只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。一、微生物接种1．琼脂斜面接种法主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。2．穿刺接种法此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。3．液体培养基接种法用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。4．倾注平板法本法主要用于液态标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本(0.2~1.0ml)至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃(28℃)培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。5．涂布接种法本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。5．涂布接种法本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。三、细菌数量的测定细菌是单细胞微生物，体积很小，个体的生长很难测定，而且也没有什么实际应用价值。因此，测定它们的生长不是依据细胞个体的大小，而是测定群体的增加量，即群体的生长。测定生长量的方法很多。1．直接计数法测定的是死、活细胞总数（1）涂片染色法（2）计数器测定法（3）比例计数法（4）电子自动计数器计数法（5）比浊法（1）涂片染色法将已知体积的待测材料，均匀地涂布在载玻片的已知面积内，经固定染色后，在显微镜下计算染色涂片上的细菌数。一般在载玻片一平方厘米的面积上，均匀涂布0．01毫升样品。（2）计数器测定法用特制的细菌计数器或血球汁数器进行计数，取一定容积稀释的单细胞微生物悬液置于计数器载玻片与盖玻片之间的计数室内，在显微镜下计数。观察结果（3）比例计数法将待测的细菌悬液与等体积血液混合后涂片，在显微镜下可以测得细菌数与红细胞数的比例。由于每毫升血液中红细胞数是已知的，这样，通过细菌数与红细胞数的比例，就可计算出每毫升样品中的细菌数。直接计数法的局限性①死、活细胞不易区分；②小的细胞很难在显微镜下观察，有一些细胞可能被遗漏；③浓度太低的细胞悬液也不能使用此法，一般106个以上/mL；④精确性也较差。（4）电子自动计数器计数法电子自动计数器具有一个特制的有孔玻璃薄膜，当定量的细胞悬液中的菌体高速地通过小孔时，由于悬液与菌体的导电性不同，便形成一个脉冲，每当一个细胞通过时就产生一个脉冲被记录下来。此设备可以高速测定菌数，而且结果也较精确。但是电子计数器不能区别其他颗粒，因此，菌悬液中应无其他碎片。（5）比浊法原理是悬液中细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细菌越多，透光量越低。此法比较简便。但样品颜色不宜太深；样品中不要混杂其他物质；同时菌悬液浓度必须在107／毫升以上才能显示可信的混浊度。2．间接计数法是基于每个分散的有机体在适宜的培养基中具有生长繁殖的能力，并且一个活细胞能形成一个菌落。菌落数就是待测样品所含的活菌数。此法所得的数值往往比直接法测定的数字小。?????平板菌落计数法1.0ml0.1ml选择30-300个菌落的平板计数倒平板不足之处①并非所有生活有机体都可在实验条件下或实验期间内生长并形成菌落②意外的损伤也可导致菌数减少③培养基温度较高，某些易受热力影响的微生物往往不能存活；④人们无法肯定一个菌落仅来源于一个细胞，以致造成实验误差。浓缩样品如果测定量大而且含菌浓度很低的样品（如空气、水等）中的活菌数时，则应将待测样品通过微孔薄膜（如硝化纤维素薄膜）过滤浓集，再与膜一起放到含培养基或浸透了培养液的支持物表面培养，然后根据菌落数推知样品含菌数。浓缩样品如果测定量大而且含菌浓度很低的样品（如空气、水等）中的活菌数时，则应将待测样品通过微孔薄膜（如硝化纤维素薄膜）过滤浓集，再与膜一起放到含培养基或浸透了培养液的支持物表面培养，然后根据菌落数推知样品含菌数。3．测定细胞物质量（1）测定细胞总含氮量（2）DNA含量测定法（3）测定细胞干重法（4）其他生理指标测定法（1）测定细胞总含氮量此法只适用于细胞浓度较高的样品。（2）DNA含量测定法通过荧光反应强度，求得DNA的含量，可以直接反映所含细胞物质的量。同时还可根据DNA含量计算出细菌的数量。每个细菌平均含DNA8.4×10-5纳克。（3）测定细胞干重法细菌的干重约为湿重的20~25％，即1毫克干菌体＝4~5毫克湿菌体＝4~5×109个菌体。此法较为直接、可靠，主要用于调查研究。但只适用于菌体浓度较高的样品，而且要求样品中不含非菌体的干物质。（4）其他生理指标通过测定微生物对氧的吸收、发酵糖产酸量、或测定谷氨酸在氨基脱羧酶作用下产生CO2的多少来确定。四、细菌的生长曲线大多数细菌的繁殖速度都很快。大肠杆菌在适宜条件下，每20分钟左右便可分裂一次……一个细菌48小时后，其子代总重量可达2．2×1031克，这是一个巨大的数字。可能吗？将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中慢-快-稳-降以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，得到的曲线称为生长曲线（繁殖曲线）根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延迟期、对数期、稳定期与衰亡期四个阶段。生长曲线延迟期对数期稳定期衰亡期1．延迟期生长速度近于零。处于延迟期细菌细胞的特点可概括为8个字：分裂迟缓、代谢活跃。延迟期出现的原因，可能是为了调整代谢。延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关。2．对数期又称指数期，细菌数以几何级数增加（1→2→4→8→……（2n））细菌纯培养的生长速率也就是群体生长的速率，可用代时（G）表示。代时:即单个细胞完成一次分裂所需的时间，亦即增加一代所需的时间（也叫增代时间或世代时间）。处于对数期的微生物，其个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛，生长迅速，代时稳定。3．稳定期又称恒定期或最高生长期。长短与菌种和外界环境条件有关。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，培养物中细胞总数达到最高水平，此时生长速度逐渐趋向零。接着死亡细胞数大大超过新增殖细胞数，曲线出现下降趋势。3．稳定期稳定期产生的原因：由于对数期细菌活跃生长引起周围环境条件发生了一系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸如pH、氧化还原电位、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂。4．衰亡期稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”--叫衰亡期。其中有一段时间，活菌数按几何级数下降，故有人称之为“对数死亡阶段”，这一阶段的细胞，有的开始自溶，产生或释放出一些产物，菌体细胞也呈现多种形态，大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。