DNA复制过程

DNA复制过程1.复制的起始（一）原核生物DNA复制过程DNA复制的起始就是要解开双链和生成引物。(1)DNA解成单链由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。复制起始的解链需要多种蛋白质参与。这些蛋白质与复制起始点的特有序列结合，促使其邻近的DNA解链。首先起始复合体（DnaA-ATP）与4×9bp重复序列结合，3×13bp(富含AT)重复序列在Ⅱ型拓扑异构酶的作用下，使3×13bp重复序列区域松弛，再在DNA解旋酶(DnaB蛋白）的作用下，3×13bp区域发生解链；复制泡被单链结合蛋白(SSB蛋白)覆盖，以免断裂和再复性；引物酶结合到模板DNA上并合成一段短的RNA，作为合成DNA的引物，引发第一个复制叉的先导链的复制，接下来是双向复制。(2)引物合成引发体引导引物酶到达适当的位置合成引物。参与原核生物复制起始的主要成分DnaA蛋白DnaB蛋白(解螺旋酶)DnaC蛋白DnaG蛋白(引物酶)SSB拓朴异构酶oriC辨认起始点解开DNA双链协助DnaB蛋白催化形成RNA引物稳定解开的单链DNA理顺DNA链大肠杆菌的复制起始点2.复制的延长1）在DNA聚合酶Ⅲ的作用下2）前导链合成1000-2000个核苷酸后3）随从链开始合成，岗崎片段的长度为1000-2000个（大肠杆菌）4）PolⅢ为不对称二聚体，一个作用于前导链，另一个作用于随从链(loop)。3′5′领头链(leadingstrand)顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行的，得到一条连续的子链。5'3'3'5'5'解链方向3'随从链(laggingstrand)复制方向与解链方向相反，须等解开足够长度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。5'3'3'5'5'解链方向3'3'5'5'3'三、复制的终止去除RNA引物补充空缺连接DNA聚合酶Ⅰ的小片段5’3’外切酶DNA聚合酶Ⅰ的大片段3’5’外切酶5’3’聚合酶DNA连接酶（二）真核生物DNA的复制特点酵母的复制起始点称为ARS(autonomouslyreplicatingsequences,自主复制序列)，长约15Obp左右，包括数个复制起始必需的保守区，其核心序列富含AT。真核生物DNA复制的起始需要起点辨认复合物(ORC)参与。真核生物DNA复制叉的移动速度比原核生物慢得多（大约只有5Obp/s，还不到大肠杆菌的1/20）。1．DNA复制起始过程真核生物有多个复制起始点(ori)。复制起始点有特殊的序列。起点辩认复合物（ORC）组装在起始部位上，形成复制叉。ORC在起始点上的组装还不足以开始起动，另一种复合物称小染色体维系蛋白（MCM）必须参与。MCM有较弱的解旋酶的活性。此外，还需拓扑异构酶、复制因子(RF)、增值细胞核抗原（PCNA）的参与。此外需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)。CDK相匹配的周期蛋白作用点CDK2CyclinD1,D2,D3G1期CyclinEG1→S期CyclinAS期CDK3和CDK4CyclinD1,D2,D3G2期CDK1（CDC2）CyclinA,BG2→M期哺乳类动物的周期蛋白和CDK哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白质，例如锚蛋白(ankynin)是CDK4的特异性抑制物，P21蛋白能抑制多种CDK。锚蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放/关闭，因此被形容为细胞周期的检查点蛋白。RF有多种如RFA、RFB、RFC等，是调节细胞DNA复制的重要蛋白质。在蛋白激酶的作用下被磷酸化，激活或抑制RF的活性。而蛋白激酶包括调节亚基（又称细胞周期蛋白）和催化亚基（又称细胞周期蛋白依赖激酶，CDK），且各有多种。从而对DNA复制起始进行精确及多样化控制,使多位点复制呈时序性而非同步性。PRA：复制蛋白A2．RNA引物的合成DNA聚合酶α能识别起始位点，并且以核糖核苷三磷酸为底物（NTP），以解开的一段DNA为模板，合成一个短链RNA（8～10个核苷酸）引物。然后从引发酶的活性转变为DNA聚合酶α的活性，RNA引物的3’-OH末端为合成新的DNA单链的起点，以dNTP为原料，延长引物大约15-30个脱氧核苷酸。3.DNA链的延伸合成的方向仍然为5’→3’。一旦冈崎片段达到一定长度，DNA聚合酶α便从DNA上解离下来。RFC结合到这一延长的引物上，并组装到PCNA滑动夹上，然后DNA聚合酶δ（polδ）结合到PCNA上并完成冈崎片段的最终长度130-200bp.当它遇到原先已形成的冈崎片段5`末端时，polδ/PCNA复合物从DNA上释放下来两条链均按5’到3’方向合成，一条链3’末端的方向朝着复制叉前进的方向，可连续合成，称前导链（leadingstrand）。另一条链5’末端朝着复制叉，合成是不连续的，形成冈崎片段，此链称后随链(laggingstrand)。4.RNA引物的水解引物的去除通过两个步骤，首先由RNaseH降解RNA引物，留下单个核糖核苷酸连接到冈崎片段上。然后，由側翼内切核酸酶（flapendonucleae1,FEN1）除去最后一个核苷酸。FEN1也能除去由于DNA聚合酶δ产生的某些错误的碱基。5．DNA大分子的形成DNA连接酶将相邻的两个DNA片段连接起来，形成大分子DNA链。由于DNA聚合酶具有校正功能，即通过它的核酶外切酶的功能，能及时切除错配的碱基，使DNA复制具有高度的保真性，保证遗传信息的稳定性。