还原糖滴定法

15.2.2.1铜还原——直接滴定法15.2.2.2姆松——华尔格法(高锰酸钾容量法)15.2.2.3常量法——氰化盐碘量法15.2.2.4夏费—索姆吉法——半微量法15.2.2.1铜还原——直接滴定法(Lane-Eynon’smethod)［1，2］Top15.2.2.1.1方法原理样品中的水溶性糖可以用80℃温水浸提，但对含淀粉和菊糖高的样品则须用800mL·L-1-850mL·L-1酒精浸提，其中还原糖可使费林(Fehling)试剂还原生成Cu2O沉淀，而本身被氧化和降解成糖酸。费林试剂是由CuSO4溶液、NaOH和KNaC4H4O6溶液组成。在碱性溶液中，酒石酸盐可与铜盐形成配离子而不致生成氢氧化铜沉淀。其反应如下：Cu2++2OH-+2(C4H4O6)2-→［Cu(C4H3O6)2］4-+2H2O在煮沸条件下，用还原糖待测液滴定一定量的费林试剂时，铜的酒石酸配离子被还原糖还原，产生红色Cu2O沉淀，还原糖则被氧化和降解，其反应示意式如下：上述反应是铜还原法测糖的基本原理。滴定时是以亚甲基蓝为氧化还原指示剂，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝，即达滴定终点。还原糖与费林试剂反应的完全程度与滴定时条件(如加热强度、温度、时间等)很有关系，故必须严格按照操作规程测定。指示剂也消耗一定量还原糖，所以每次滴定时须按规定加入相同数量的亚甲基蓝。本法适宜于含糖量高的样品(15—50mL糖液中含糖50mg)。15.2.2.1.2主要仪器高速组织捣碎机；电热恒温水浴锅；玻塞滴定管(附弯形尖管，见图15-1)图15-1弯形尖管规格及安装图1.玻塞滴定管2.橡皮圈3.橡皮管4.弯形尖管(管径为5mm)15.2.2.1.3试剂(1)Soxhlet修正的费林(Fehling)溶液：应用前立刻配制，通过下列费林试剂A和B溶液等体积混合而制得。①费林试剂A：溶解CuSO4·5H2O34.639g于水中，移入500mL容量瓶中，用水定容。②费林试剂B：溶解酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)173g和NaOH50g于少量水中，洗入500mL容量瓶中，用水定容。(2)100g·L-1中性醋酸铅溶液：称100g醋酸铅［Pb(CH3COO)2·3H2O］(化学纯)溶于水中，过滤后稀释至1L。(3)Ba(OH)2饱和溶液：在100mL无CO2水中，加入固体Ba(OH)2·8H2O(化学纯)约6g，用玻棒搅拌，将烧杯盖好过夜，次日滤去未溶物，溶液装在细口瓶中备用。为了防止与空气中CO2接触，应装设碱石灰管及虹吸管。(4)Na2SO4饱和溶液：称Na2SO4·10H2O(化学纯)165g，溶于1L水中。(5)50g·L-1硫酸锌溶液：称取ZnSO4·7H2O(化学纯)50g，加水溶解，并用水稀释至1L。(6)850mL·L-1及800mL·L-1乙醇(C2H5OH)溶液：取950mL·L-1乙醇(分析纯)85mL，加水稀释至95mL，即为850mL·L-1乙醇溶液。取950mL·L-1乙醇80mL，加水稀释至95mL，即为800mL·L-1乙醇溶液。(7)固体草酸钠(Na2C2O4)试剂(分析纯)。(8)10g·L-1亚甲基蓝水溶液：称亚甲基蓝1.00g溶于水中，加水稀释至100mL。(9)2mg·mL-1葡萄糖标准溶液：称取干燥的葡萄糖(优级纯)0.2000g用少量水溶解后，洗入100mL容量瓶中用水定容。15.2.2.1.4操作步骤(1)待测液制备①水提取法：清除新鲜水果、蔬菜样品外来污染的杂质，尽可能快地磨细或切碎，混匀，称取样品25.00g—50.00g(含糖约2.5g)，置高速组织捣碎机中，加适量水后捣碎(或置研钵中加少量纯石英砂共同研磨)，然后小心移入250mL容量瓶中，加水至约150mL；或风干已磨细的样品则可称取0.500—5.00g，洗入250mL容量瓶中，亦加水至约150mL。然后加入粉状CaCO30.5—1.5g中和样品中的酸度(防止浸提过程中蔗糖水解)，摇动1min，置于80℃水浴中保温浸提0.5h，其间摇动数次以利糖分浸提完全。冷却，滴加100g·L-1中性醋酸铅溶液至产生白色絮状沉淀，充分摇动混合，静置15min，再滴加几滴中性醋酸铅溶液于上部清液中检查是否沉淀完全。如果还有沉淀形成，再摇动，静置，直至不产生白色絮状沉淀为止(约2—5mL)，用水稀释定容。用干滤纸过滤。加入足量草酸钠固体到滤液中，使铅沉淀完全，再用干滤纸过滤，再用固体草酸钠少许加到滤液中，检查铅是否沉淀完全。无铅的滤液待用。②乙醇提取法：称取剪碎、混匀的新鲜植株样品(含大量淀粉或菊糖的样品)25.00g或是干样称0.500—5.00g，放入400mL烧杯中，加入850mL·L-1乙醇150mL浸泡过夜(另测样品水分)。倒入高速组织捣碎机的杯中捣碎，再倒回原烧杯中，用800mL·L-1乙醇将杯壁上的样品洗净，一同倒入烧杯中，过滤入250mL容量瓶中，再用800mL·L-1乙醇少量多次洗涤残渣，直至滤液无糖反应为止(注1)。最后以800mL·L-1乙醇定容。吸取乙醇浸出液25.00—50.00mL(吸取量视含糖量与方法而定)，放入瓷蒸发皿中，如溶液呈酸性，用固体CaCO3中和，在60—80℃水浴上蒸干乙醇，后加入少量无CO2水，用橡皮头玻棒将干物质洗下，边搅边加入Ba(OH)2饱和溶液2—10mL，至溶液呈淡黄色(碱性)，此时絮状蛋白质沉淀物浮在液面。加入酚酞指示剂1滴，在不断搅动下加入50g·L-1ZnSO4溶液以沉淀过量的Ba2+，直到溶液呈微红色时为止。过滤入50mL容量瓶中，用少量水洗涤沉淀后定容，待测。(2)还原糖测定。试液呈中性或接近于中性，其滴定步骤如下：①约测：准确吸取未混的费林试剂A和B各5mL或12.5mL(或吸取混合费林试剂10mL或25mL)，放入250mL三角瓶中，由滴定管加入待测糖液约15mL，置在石棉网上加热煮沸，趁沸继续滴加糖液(注2)，滴加速度约为10—15s之内加入1mL，直至溶液蓝色即将消失，加入10g·L-1亚甲基蓝指示剂3滴，继续滴加糖液，直至蓝色褪尽为止(注3)，记下待测糖液的用量(mL)。②精密滴定：准确吸取未混的费林试剂A和B各5mL或12.5mL(或吸取混合费林试剂10mL或25mL)，放入250mL三角瓶中，加入待测糖液，其用量比上述滴定量约少0.5—1.0mL，置在石棉网上加热，使之2min内沸腾，维持沸腾2min后，加入亚甲基蓝指示剂3滴，再逐滴地加入待测糖液，直至蓝色褪尽。前后总沸时间为3min。准确记下待测糖液的消耗量(V1)，须在15—50mL范围内(含糖量近50mg)，否则应增减称样量，重新制备待测液。(3)费林试剂的标定同上15.2.2.1.4(2)①,②操作条件，葡萄糖标准溶液也分“约测”及“准确测定”二步进行。准确记下消耗标准糖液用量为V0(测定三次取平均值)。15.2.2.1.5结果计算还原糖，%=标准糖溶液浓度(2mg·mL-1)×V0×V/(m×V1)×100式中：V0—滴定10mL费林试剂所消耗标准葡萄糖液的量(mL)；V1—滴定10mL费林试剂所消耗待测糖液的量(mL)；V—待测糖液的总体积(mL)；m—样品质量(mg)；15.2.2.1.6注释1.检验糖方法：于白色点滴板的孔穴中加1%α-萘酚乙醇溶液2滴和浓H2SO410滴，混匀，加入待检的淋洗液1滴，1min后如无红圈出现，证明糖已洗净。2.还原糖与碱性酒石酸铜试剂反应速度较慢，必须在加热至沸的情况下进行滴定。为了防止烧伤及便于滴定操作，可于滴定管尖部加接一弯形尖管，弯形尖管规格及安装如图15—1所示。并戴上隔热手套操作。3.无色的还原型亚甲基蓝极易被大气中的O2所氧化，恢复原来的蓝色，故整个滴定过程中三角瓶不能离开电炉，使瓶中的溶液始终保持沸腾状态，液面覆盖水蒸汽，不与空气接触。15.2.2.2姆松——华尔格法(Munson-Walker法)［2］(高锰酸钾容量法)Top15.2.2.2.1方法原理将样品试液与过量的费林氏试剂反应，过滤取得生成物Cu2O后，用直接称量法测知Cu2O的质量；或用容量法测知生成物中铜的质量。然后从表15-2(哈蒙德，Hammond)表查得与铜量相当的糖量，再计算样品的含糖量。由于这种方法所得结果准确，重现性好，但花费时间较多。美国AOAC分析方法1985年版介绍此法测定糖和糖浆中的转化糖。高锰酸钾容量法，其反应为：Cu2O+Fe2(SO4)3+H2SO4→2CuSO4+2FeSO4+H2O10FeSO4+2KMnO4+8H2SO4→5Fe2(SO4)3+2MnSO4+K2SO4+8H2O由反应式可知，10摩尔铜相当于2摩尔的高锰酸钾，则每mL1/5mol·L-1KMnO4溶液相当Cu量。x为158∶63.57×5=158/5∶x，x=63.6mg。所以，已知高锰酸钾滴定量，就可计算成铜的质量，由表15-2计算样品的含糖量。15.2.2.2.2试剂(1)高锰酸钾标准溶液(约为0.03152mol·L-1)，称取KMnO44.98g溶于水中，煮沸过滤，放冷，稀释至1L，此液1mL相当于10mgCu。(2)硫酸高铁溶液：溶解硫酸高铁(无水)Fe2(SO4)355g或硫酸铁铵FeNH4(SO4)2·12H2O135g于水中，稀释1000mL。(3)Soxhle修正的费林溶液：(同15.2.2.3.1)(4)邻菲啉亚铁指示剂：溶解邻菲啉水合物0.7425g于0.25molL-1FeSO4溶液(FeSO4·7H2O6.95g·L-1)25mL中。15.2.2.2.3操作步骤试液应呈中性或弱碱性，应除去还原性干扰成分，并脱去铅。吸取费林溶液A，B各25mL，置于400mL玻璃烧杯中，加入样品试液50mL，若样品试液容积较少，则可加水将溶液总容积调整到100mL。将烧杯置于电炉石棉网上加热，盖上表面玻璃，使在4min内沸腾，并继续保持混腾2min(此操作必须严格遵守)。立即趁热利用抽滤法通过事先已做好石棉垫的古氏坩埚或玻璃滤器(3、4号)过滤，用60℃热水沏底洗涤Cu2O沉淀和烧杯，直至不呈碱性为止。并将坩埚或玻璃滤器外壁洗净，然后把古氏坩埚或玻璃滤器移入原烧杯中，加入Fe2(SO4)3溶液50mL，剧烈搅拌至Cu2O完全溶解。加2mol·L-1H2SO420mL，用玻棒不断搅拌坩埚，用标准KMnO4溶液滴定，当近终点时，加邻菲罗啉亚铁指示剂1滴，达到终点时由棕色溶液变为绿色。由高锰酸钾标准溶液滴定量换算成铜，再查表15-2，计算相当的还原糖质量(mg)。15.2.2.2.4结果计算还原糖(%)=[查表得还原糖mg数×分取倍数]/样品质量(mg)×100式中：分取倍数=样品试液的总体积/测定时吸取试液的体积注：这里还原糖是指葡萄糖或果糖。表15-2哈蒙德(Hammond)表——计算单一的及与蔗糖共存的葡萄糖、果糖、转化糖和乳糖*()**单位：mg铜***葡萄糖果糖转化糖转化糖和蔗糖水合乳糖C11H22O11·H2O水合乳糖C11H22O11·H2O与蔗糖共存氧化亚铜****水合麦芽糖C11H22O11·H2O总糖0.3克总糖0.4克总糖2.0克1分乳糖4分蔗糖1分乳糖12分蔗糖104.65.15.23.22.9-7.77.76.6106.2209.410.410.28.37.91.915.415.213.62014.63014.315.815.313.413.07.023.622.620.73022.94019.221.120.418.618.212.130.630.127.84031.35024.126.525.523.823.317.338.337.635.05039.66029.031.930.628.928.522.546.045.142.16048.07034.037.435.834.233.727.753.652.549.37056.38039.042.841.039.438.932.961.360.056.58064.69044.048.346.244.