色谱分析法概论

LOGO现代分析测试技术生命科学与工程学院魏屹2010-05-10第一章色谱分析法概论第四节色谱法的基本理论第三节色谱法的基本术语第二节色谱法的分类第一节色谱法的定义、特点及其发展历史第五节色谱法定性和定量分析色谱法的创始人是俄国的植物学家茨维特（M.Tswett）。1906年，俄国植物学家茨维特发表了他的实验结果：为了分离植物色素，他将含有植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，从而形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱法(chromatography)。视频第一节色谱法的定义、特点及其发展历史Tswett实验图示：植物叶色素的分离实验色谱柱—玻璃柱固定相—CaCO3颗粒流动相—石油醚随着分离手段的不断发展，越来越多的无色物质成为被分离的对象，色谱也渐渐失去了“色”的含义，但这个名称却沿用至今。色谱分析法（Chromatography）简称色谱法或层析法，是一种物理或物理化学分离分析方法，该法利用某一特定的色谱系统（薄层色谱、高效液相色谱或气相色谱等系统）进行混合物中各组分的分离分析，主要用于分析多组分样品。固定相：在色谱分离中固定不动，对样品产生保留的一相。流动相：带动样品向前移动的另一相。一、色谱法的定义二、色谱法的特点优点：1、分离效率高2、分析速度快3、灵敏度高4、样品量少5、应用范围广6、选择性好7、易于自动化特点缺点：定性能力不如光谱法强三、色谱法的发展简史(一）色谱法的诞生1906年，茨维特创立液相色谱法1931年，库恩等人，用氧化铝和碳酸钙分离α-,β-,γ-胡萝卜素，确定维生素A的结构，获得了1938诺贝尔化学奖。色谱法得以复兴，并开始广泛应用。色谱法的发展简史(二）色谱法的发展1、色谱理论的发展：1941年，马丁和辛格等，提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气相色谱。1956年，范第姆特等，提出色谱速率理论，奠定了气相色谱和液相色谱的理论基础。1958年，戈雷基于VanDeemter方程提出影响毛细管峰展宽的主要因素，从而导出了毛细管柱的速率理论方程。1965年，吉丁斯发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。色谱法的发展简史2、色谱方法的发展（1）薄层色谱法：1938年，Izmailov和Shraiber，最先将氧化铝涂在玻璃板上，用来分离药物。1956年，薄层色谱法的概念被正式提出。1964年，薄层扫描光密度计被发明。近年，超薄层色谱法（UTLC），因其仅10um的硅胶层整体结构，显著降低了迁移时间和溶剂消耗，并提高了灵敏度，为薄层色谱法开创了一个全新领域。色谱法的发展简史（2）气相色谱法：1952年，James和Martin，正式提出气相色谱法，并精辟地阐述了气相色谱的理论及实践方法，因此被授予诺贝尔化学奖。1954年，热导检测器用于气相色谱。1958年，产生毛细管气相色谱，随后几年，氢火焰离子化检测器及电子捕获检测器陆续问世，把气相色谱的检测灵敏度提高到了一个新高度。20世纪60年代，推出了气相色谱-质谱联用技术，有效弥补了气相色谱定性能力差的弱点。色谱法的发展简史（3）高效液相色谱法：高效液相色谱法是20世纪60年代中后期发展起来的学科，它的基础是经典液相柱色谱和气相色谱。1959年，凝胶过滤色谱、凝胶渗透色谱、高效体积排阻色谱相继问世。1966年，第一只小体积紫外检测器问世，并经改进成为液相色谱中最通用的检测器，70年代后，各种商品化的荧光检测器、电化学检测器开始问世。80年代，出现了二极管阵列检测器，HPLC-MS等色谱-光谱联用技术。2004年，Watres公司推出了超高效液相色谱系统。2010-05-10第一章色谱分析法概论第四节色谱法的基本理论第三节色谱法的基本术语第二节色谱法的分类第一节色谱法的定义、特点及其发展历史第五节色谱法定性和定量分析第二节色谱法的分类流动相：气相色谱、液相色谱、超临界流体色谱固定相：气－固、气－液；液－固、液－液柱色谱：填充柱色谱、毛细管柱色谱、微填充柱色谱、制备色谱平面色谱：纸色谱、薄层色谱、高分子膜色谱吸附色谱：根据不同组分在吸附剂上的吸附和解吸能力的大小而分离分配色谱：根据不同组分在固定液中溶解度的大小而分离分子排阻色谱：依据分子体积大小不同进行分离离子交换色谱：不同组分对离子交换树脂的亲和力不同而分离亲和色谱：利用生物大分子之间的存在的专一的特殊亲和力进行分离毛细管电泳：依据各组分淌度和（或）分配行为的差异进行分离手性色谱：用于手性药物的分离分析，可分为三类：凝胶渗透色谱法凝胶过滤色谱法手性衍生化试剂法手性流动相添加剂法手性固定相拆分法2010-05-10第一章色谱分析法概论第四节色谱法的基本理论第三节色谱法的基本术语第二节色谱法的分类第一节色谱法的定义、特点及其发展历史第五节色谱法定性和定量分析第三节色谱法的基本术语一、色谱分离过程二、色谱法的基本术语三、容量因子与分配系数四、保留值与容量因子及分配系数的关系链接一、色谱分离过程检测色谱分离后组分的响应信号对时间作图得到的曲线称为色谱图。色谱流出曲线AOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0二、色谱法的基本术语包含信息：tR；h或A；σ,W1/2,W。名词术语：基线、色谱峰；峰高h、峰面积A；峰宽W、半峰宽W1/2、标准偏差σAOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’AOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’基线：在一定色谱条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的信号的曲线，称为基线，如图中ot线。实验条件稳定时，基线是一条平行于横轴的线；基线反映仪器（主要是检测器）的噪声随时间的变化。AOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图AB’线。AOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’区域宽度：色谱峰的区域宽度直接与分离效率有关。描述色谱峰宽的方法有三种：标准偏差σ、峰宽W、半峰宽W1/2。AOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’标准偏差（σ）：σ为正态分布曲线上两拐点间距离之半，σ值的大小表示组分离开色谱柱的分散程度。σ值越大，流出的组分越分散，分离效果变差；反之，流出组分集中，分离效果好。AOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’峰宽W：通过色谱峰两侧的拐点作切线，在基线上的截距称为峰宽，或称基线宽度，也可用W表示，如图IJ的距离。根据正态分布的原理，可证得峰宽和标准差的关系是W=4σ。AOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽称为半峰宽，如图GH的距离。W1/2=2.355σ，W=1.699W1/2。W1/2、W都是由σ派生而来的，除用它们衡量柱效外，还用于计算峰面积。半峰宽测量较方便，最为常用。保留值是用来描述样品组分在色谱柱中保留程度的参数，并作为色谱定性的指标。其表示方法有：色谱保留值相对保留时间保留指数AOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’：从进样到柱后出现浓度最大值所需的时间，一般以s或min为单位。：从进样到柱后出现浓度最大值所需流动相的体积，一般以ml为单位。AOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’：不保留物从进样到柱后出现浓度最大值所需的时间，一般以s或min为单位。在以甲醇-水为流动相的反相HPLC中，甲醇峰的保留，气相色谱中空气峰（GC-TCD）和甲烷峰（GC-FID）的保留时间可近似看作死时间。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与tM的比值计算，即ū=L/tMAOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’：不保留物从进样到柱后出现浓度最大值所需流动相的体积。死体积包括进样器至色谱柱管路的空间、固定相颗粒间隙、柱出口管路及检测器内腔空间的总和。死体积大，被分离组分的色谱峰展宽，分离效果差。AOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’：保留时间扣除死时间后的保留值。在实验条件（温度、固定相等）一定时，调整保留时间只取决于组分的性质，因此调整保留时间是色谱法定性的基本参数。AOAEGFH进样空气峰CIDJtBh21h607.0h221/WW0tRRtt信号O0tB’：保留体积扣除死体积后的保留值。相对保留值相对保留值：又称分离因子、分配系数比或相对容量因子，即在一定色谱条件下，被测组分的调整保留时间（体积）与标准物的调整保留时间（体积）之比。采用相对保留值是为了消除某些操作条件，如流速和固定液流失等，对保留值的影响。相对保留值中标准物可以是被测样品中的某一组分，也可以是人为加入的某一化合物。I为待测物质i在某固定液X上的保留指数，选取两个正构烷烃作为基准物质，其中一个的碳数为N，另一个为N+n，它们的调整保留时间分别为tR(N)和tR(N+n)，使待测物质i的调整保留时间tR(i)恰好于两者之间，即tR(N)tR(i)tR(N+n)。将含物质i和所选的两个正构烷烃的混合物注入其固定液X的色谱柱，在一定温度条件下绘制色谱图。保留指数信号tR(N)tR(i)tR(N+n)t进样保留指数计算式：)()()()(lglglglg100NRnNRNRxRttttnNI•当相邻两个正构烷的碳数差值n=1时，保留指数或简化为：)()1()()(lglglglg100NRNRNRxRttttNI保留指数计算式的来源：保留指数是国际公认的用于气相色谱法中物质的鉴定和定性的相对保留值。理论基础为，正构烷烃调整保留时间的对数（lgtR）与其相应的碳数（N）呈线性关系。由此可推出保留指数计算式。baNtlg保留指数的物理意义在于：它是与被测物质具有相同调整保留时间的假想的正构烷烃的碳数乘以100。保留指数仅与固定相的性质、柱温有关，与其它实验条件无关。其准确度和重现性都很好。只要柱温与固定相相同，就可应用文献值进行鉴定，而不必用纯物质相对照。1、容量因子(k)：在平衡状态下，组分在固定相(s)与流动相(m)中的质量之比，称为容量因子。公式如下：三、容量因子与分配系数2、分配系数（K）：在平衡状态下，组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度之比，称为分配系数。公式如下：三、容量因子与分配系数K与k的关系：kVVkVmVmCCKsmmmss//mS相比反映了色谱柱的柱型及其结构的重要特性色谱分离是基于固定相对试样中各组分的吸附或溶解能力强弱的不同，而这种吸附或溶解能力的强弱可定量地用分配系数K（或容量因子k）值的大小来表示。吸附或溶解能力强的组分分配系数（或容量因子）大，保留时间长；反之，吸附或溶解能力弱的组分分配系数小，保留时间短。四、保留值与容量因子及分配系数的关系四、保留值与容量因子及分配系数的关系设在单位时间内，溶质分子在流动相中出现的概率为R，若R=1/3，则该溶质有1/3分子出现在流动相中，2/3的分子