分子细胞生物学复习资料汇总

1分子细胞生物学1．分子细胞生物学的研究方法；2．近年来蛋白质和核酸的结构和功能研究进展；3．生物膜运输物质的分子机理；4．细胞各部位蛋白质的合成和定向运输的分子机理；5．细胞核的分子结构以及细胞核和细胞质之间物质运输的分子基础；6．细胞信号传导的分子机理。第一章分子细胞生物学学科简介和研究方法本章重点难点：分子水平上的操作技术。一、分子细胞生物学的研究对象和内容p1-2二、分子细胞生物学与其他学科的关系p1-2三、分子细胞生物学的研究方法-（一）、研究细胞的组成和结构1.荧光显微镜下鉴别细胞的组成和结构p2-4（1）免疫荧光法（2）活细胞研究（3）检测局部Ca2+浓度和细胞内的pH（4）共聚焦扫描显微镜展示细胞内物质的立体分布2.在电子显微镜下鉴别细胞中的各种蛋白质的分布和超微结构p4利用抗体和抗原特异性结合的原理，电子致密度大的物质（金颗粒）作为标记，蛋白A起桥梁作用（蛋白A能同抗体Fc片段结合）。3．鉴定蛋白质的亚细胞定位或特殊细胞定位p5（1）将目标基因与标记基因（荧光蛋白基因GFP、RFP、YFP）融合，确定目标蛋白质的亚细胞定位（2）用目标基因的启动子驱动标记基因，确定目标蛋白质在不同细胞中的分布，时空表达特点等2（3）荧光显微镜或共聚焦扫描显微镜例如：GUS，葡糖醛酸酶，可催化化学反应，加入底物后有GUS表达的位置显蓝色。4.蛋白质亚细胞定位和超微结构定位的对比鉴定p6标记蛋白miniSOG（小型单线痒制造者，有黄素蛋白、向光蛋白2等），表达后会发出绿色荧光，蓝光下miniSOG产生单线态氧可局部催化二氨基联苯胺（DAB）聚合形成嗜锇产物，嗜锇产物店子致密度高-电子显微镜下可见。5.检测大量元素和微量元素在细胞内的分布p6（1）用Na2S沉淀金属离子（2）用透射电子显微镜-能量散射广谱仪分析细胞营养元素的分布（二）、细胞的分离和细胞器的分离1.流向细胞分类器，荧光激活细胞分类器p7具体特点见ppt2.激光捕获微分离系统p7具体特点见ppt激光捕获显微切割即Lasercapturemicrodissection(LCM)technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，成功地解决了组织中的细胞异质性问题，从而可以进行纯细胞的蛋白质组研究。其原理是用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上，然后用红外激光熔化膜，这时膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目标细胞留在膜上，这些细胞直接在膜上进行裂解，再进行2DE分离及蛋白质组分析或用SELDIT0F进行分离与分析。此方法大大提高了随后分析(2DE，SELDI．TOF等)的重现性和准确性，是目前较为理想的细胞提取工具，已经用于膀胱癌、结肠癌等标本的准备3.细胞亚微结构的分级分离p7-8（1）差速离心法.（根据细胞亚微结构的颗粒大小和密度差别，采用不同离心速度分离各种结构）（2）密度梯度离心法（根据亚微结构的密度差别达到离心的目的，用蔗糖、甘油或氯化铯作为密度梯度的介质，高速离心机40000r/min，被分离物质分布在相3应的密度带内）（3）激光剪（三）、生物大分子的操作1.放射性同位素是跟踪生物大分子活动必不可少的工具（1）放射自显影术（主要用于核酸）p8-9分类a：整体放射自显影（用肉眼观察，RFLP技术中，32p标记的DNA的放射自显影）b:体外培养细胞的放射自显影（借助显微镜观察，将细胞放在盖玻片上培养）c:显微（超微）放射自显影（借助显微镜或电子显微镜观察，含放射性同位素组织切片的放射自显影）感光材料：X光胶片，液体乳胶（2）放射性同位素的定量测定p9-10种类：a：盖革计数器（常用于检测污染，特点见ppt）b:液闪计数器（特点和例子见ppt）（3）脉冲-跟踪技术p10-11（采用同位素跟踪技术研究生物大分子代谢活动的方法）基本步骤和研究实例见ppt2.确定核酸和蛋白质分子的大小以及分离和纯化核酸和蛋白质（1）电泳法p11（需要从凝胶中进一步分离大分子，分离效果好，分离量小）a．琼脂糖凝胶p11b.电泳脉冲电泳p11c.等点聚焦p12d.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳p12e.双向电泳p12f.PAGEp12脉冲场凝脉电泳(Pulsedfieldgelelectrophoresis，PFGE)，是近年发展起来的一种重要的分离大分子量线性DNA分子的电泳技术。PFGE的基本原理是在琼脂糖凝胶上外加交变的脉冲电场，其方向、时间和电流大小交替改变，每当电场方向发生改变时，大分子DNA便滞留在凝胶孔内，直至沿新的电场轴重新定向后，才能继续向前泳动，DNA分子越大，这种重新定向需要的时间就越长，当DNA分子改变方向的时间小于脉冲时间时，DNA就可以按照其分子量大小分开，经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。等电聚焦电泳等电聚焦电泳（IFE，isoelectricfocusingelectrophoresis）利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质4不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。基本原理在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。（2）离心法p13（方便，分离量大，分离效果不如电泳法好）速率-区带离心法p13密度梯度离心p13（3）色谱法p14（常用此法大量分离未变性的蛋白质和DNA,色谱柱越长分离效果越好，自制色谱柱）凝胶过滤色谱法p14离子交换色谱法p14亲和力色谱法p14-15（4）透析p15(将蛋白质或核酸与其它小分子和离子分开)（5）PCR技术p15简并引物（degenerateprimer）定义：获得序列未完全清楚的核酸的一种引物设计方案，特点是所设计的引物序列某位置的核苷酸可以分别是两个或两个以上不同的碱基，结果所合成的引物是该位置上不同序列的混合物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。核苷酸链中除出现正常的A、T、G、C四种碱基符号外还出现如R、Y、M、K等其它字母（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T,N=A/C/G/T）。巢式引物（nestedprimer）定义：为巢式聚合酶链反应所设计的引物，第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的。巢式PCR5定义：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片断。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片断。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。从而提高反应的特异性。巢式PCR，可以在10的六次方基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，也不像二次PCR容易产生成片的产物，是效果最好的PCR，但也因此是最容易污染的PCR。实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1.Ct值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。2.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10´SDcycle6-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。4.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核6苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所示。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。3.确定蛋白质的氨基酸成分（1）蛋白质的氨基酸组成p15分解蛋白质成游离氨基酸（6NHCl，110度，24h）离子交换色谱法分离不同的氨基酸并确定其含量（氨基酸分析仪）（2）蛋白质的氨基酸序列p16降解法：异硫氰酸苯酯（特异性与肽链氨基端aa结合在一起，成环后脱下一个aa，可循环）微酸环境离子交换色谱法确定环状化合物的性质氨基酸测序仪（3）用抗体检测蛋白质并作定量分析p16①ELISA两级抗体，酶或荧光物质作为标记物，灵敏度很高②Westernblot灵敏度高，能检测出非常少量的蛋白质4.确定DNA序列（1）传统测序法--双脱氧链终止法p16（2）新一代测序技术p17（四）、生物芯片技术7A．生物芯片技术是一种大通量的生物分析技术（效率高，准确率高，所需样品量小）；生物芯片是这一分析技术中的信息储存或分析的材料。1.主动式芯片技术p18-17（概念特点见ppt）（1）PCR芯片（2）心脏内置芯片（3）胎儿异常红细胞分离芯片2.被动式芯片技术（1）寡核苷酸芯片技术p19-20主要用途，所需设备，工作原理，举例，优点，缺点见ppt（2）基因芯片技术p20-22种类，支撑物，命名，设备，用途，原理，优点，缺点见ppt（3）蛋白质芯片技术p22研究蛋白质间的互作；研究蛋白质与DNA之间的互作；药物筛选。（4）细胞芯片（5）组织芯片（6）全基因组覆瓦式寡核苷酸芯片技术p22在全基因组水平上分析基因表达分析DNA和RNA水平上调控基因表达的调控成分其他用途：鉴定DNA缺失或插入突变体B．基于测序的全基因组表达分析技术（转录组技术；数字基因表达谱）p22基于测序的全基因组表达分析技术与全基因芯片技术比较：可以发现新基因；鉴定不同的转录本；数据分析相对复杂；成本相对高。（五）、生物信息学分析方法生物信息学是生命科学领域和信息科学领域一门新兴的、应用型交叉学科，采用数理和信息科学的理论、技术和方法分析生物