第十九章 平面色谱法

第十九章平面色谱法一教学内容1.平面色谱法相关参数的计算2.薄层色谱法的分离原理、类型和特点3.薄层色谱法的主要操作步骤及色谱条件的选择4.纸色谱法的分离原理及实验条件。二重点与难点1.平面色谱法相关参数的计算2.薄层色谱法的分离原理、主要操作步骤、色谱条件的选择3.纸色谱法的分离原理及实验条件。教学目标1.掌握平面色谱法的基本分离原理及相关参数的计算（比移值、相对比移值、分离度）；薄层色谱法的特点；吸附薄层色谱中吸附剂和展开剂的选择原则。2.熟悉薄层色谱法的主要操作步骤。3.了解薄层扫描法的应用及技术；纸色谱法的分离原理及色谱条件。第十九章平面色谱法特点：操作简单，分析速度快，结果直观，分离能力较高。平面色谱法：组分在以平面为载体的固定相和流动相之间吸附或分配平衡而进行的一种色谱方法。第一节平面色谱法的分类和原理薄层色谱法：纸色谱法薄层电泳法一、平面色谱法的分类吸附薄层色谱法分配薄层色谱法分子排阻薄层色谱法二、平面色谱法参数（一）定性参数1.比移值Rf(retardationfactor；Rf)Rf范围：0Rf1Rf=0.2~0.8（常用）Rf=0.3~0.5（最佳）0LLRf原点到溶剂前沿的距离心的距离原点到组分斑点质量中L0L1L2图19－1011LLRf022LLRf2.相对比移值Rr讨论（1）参考物与被测组分在完全相同条件下展开可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；（2）参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分（3）相对比移值Rr与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于1sisfifLLRRRr中心的距离原点到参考物斑点质量心的距离原点到组分斑点质量中）（）（例1：化合物A在薄层板上从原点迁移7.6cm，溶剂前沿距原点16.2cm，（1）计算化合物A的Rf。（2）在相同的薄层色谱展开系统中，溶剂前沿距原点14.3cm，化合物A的斑点应在此薄板何处？cmfRLLLLRf72.647.03.14047.02.166.70解：例2：样品和标准品经过薄层分离后，样品斑点中心距原点9.0cm，标准品斑点中心距离原点7.5cm，展开剂前沿距原点15cm，试求样品及标准品的Rf值和Rr值？2.15.06.05.00.155.7026.00.150.901标准品样品标准品样品RfRfRrLLRfLLRf解：（二）相平衡参数相平衡参数：分配系数K和容量因子k前面推导出Rf＝L/L0=ut/u0t，定时展开时R’＝RfmSmmSSVVKVCVCRR''1kR11'LLLVVKmS0讨论⑴Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关，K↑大，Rf↓小⑵薄层板一定，Rf只与组分性质有关，对于极性组分，展开剂极性↑大，Rf↑大（容易洗脱）展开剂极性↓小，Rf↓小（不容易洗脱）⑶Rf＝1K=0组分在前沿Rf＝0K=∞组分在原点0.01K100mSfVVKRR11'kRf11（三）面效参数1、理论塔板数n=16(L/W)2L:原点到斑点中心的距离W：组分斑点的纵向宽度L一定，斑点越集中，W越小，n越大，面效越高。2、塔板高度H=L0/nL0：原点到展开剂前沿的距离n越大，H越小。（四）分离参数1.分离度(resolution;R)R=2(L2-L1)/(W1+W2)=2d/(W1+W2)R≥1TLC:将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法特点:分离能力强、灵敏度高、展开时间较短、显色方便一、主要类型（一）吸附薄层色谱固定相为吸附剂的薄层色谱。利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离.经过吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物得到分离。K大，Rf值小，移动慢；K小，Rf大，移动快。一、主要类型（二）分配薄层色谱固定相为液体，吸留在载体上的薄层色谱。利用被分离组分在固定相与流动相中的分配系数不同而被分离。常用的是反相薄层色谱法，固定相是烷基化学键合相，展开剂是水及与水相溶的有机溶剂。二、吸附剂和展开剂（一）吸附剂硅胶：多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。原理：硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键（吸附性）。组分与硅醇基形成氢键（被吸附）的能力不同而分离。应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、醛类等活度与含水量的关系：含水量高，活性级别越高，活度越低。活化：加热至105~110℃左右，除去吸附水提高活度。（注意温度不可过高）分离效率：与其粒度、孔径及表面积等有关。常用硅胶：硅胶H，不含黏合剂硅胶G，含煅石膏硅胶GF254，含煅石膏和一种无机荧光剂，即锰激活的硅酸锌，在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。氧化铝碱性氧化铝(pH9.0)——分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素等；中性氧化铝(pH7.5)——分离酸性及对碱不稳定的化合物；酸性氧化铝(pH4.0)——酸性化合物的分离。含水量越高，活性越弱。（二）展开剂常用的有：石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烷苯甲苯二氯甲烷乙醚氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇吡啶酸水吸附剂与展开剂的选择吸附剂的选择：根据被测物极性和吸附剂的吸附能力被测物极性强——弱极性吸附剂被测物极性弱——强极性吸附剂展开剂的选择根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性图19－3展开剂混合溶剂先用单一溶剂展开，若Rf值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，如果Rf值太大，则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等)，以降低极性。可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。三、操作方法定性分析——窄条定量分析——10×20cm硅胶G——自含粘和剂硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC硅胶FH254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光硅胶FH365——含荧光剂，365nm紫外光照发光（一）薄层板的制备（二）点样：用毛细管或微量注射器，几微升，2~4mm（三）展开：见续页（四）显色方法：日光、紫外光(254、365nm)显色剂等展开：层析缸，预饱和，防止边缘效应浸入展开剂深度0.51.0cm，展开至整板3/4距离,标记。1,2样品3标准品前沿原点•••1.5-2.0cm2.0cm123展开操作时应注意的事项：1.色谱缸密闭性能好。2.注意防止边缘效应。3.将薄板下端浸入展开剂中展开时，薄板上的点样点不得浸入展开剂中。4.在展开过程中注意恒温恒湿。边缘效应是指同一物质的斑点在同一薄板上出现的两边缘部分的Rf值大于中间部分的Rf值的现象。展开之前，先将展开剂预饱和15min或在展开装置的内壁贴上浸湿了展开剂的滤纸。四、定性和定量分析定性分析——利用Rf值，与对照品的Rf值比较，同时在一块薄层板上进行。也可采用相对比移值定性。定量分析——洗脱法，薄层扫描法五、高效薄层色谱法高效薄层色谱法（HPTLC)所用的吸附剂颗粒很小（5μm或10μm），用喷雾法制成高效薄层板。常用的有硅胶、氧化铝、纤维素和化学键合相预制薄层板。六、薄层扫描法薄层扫描法是用一定强度光束照射薄层上的斑点，用仪器测量照射前后光束强度的变化，从而求得物质含量的方法。检测方法吸收测定法和荧光测定法测量方法投射法和反射法扫描方式单波长和双波长定量方法外标两点法定量第三节纸色谱法以纸做载体的色谱法，分离原理属于液-液分配色谱法，操作与薄层法类似。固定相：纸纤维吸附的水流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇）分离机制：同液-液分配色谱定性参数：mSfVVKR11讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关极性组分→易保留，Rf小（流动相极性↑，Rf↑）非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf↓）1.组分性质化合物极性大或亲水性强，组分K值大，Rf小化合物极性小或亲脂性强，组分K值小，Rf大2.pH离解度越大，极性越强，引起组分K的变化3.纸的性质4.展开的距离（展开距离↑，Rf↑）（展开距离↓，Rf↓）二、影响比移值的主要因素例3：用纸色谱分离由A、B两组分组成的混合溶液，已知它们的Rf值分别为0.45、0.63，欲使分离后两斑点中心距离不小于2cm，问滤纸最少要多长？1145.050545.063.02ARfALLcmxARfBRfxx解：设A组分斑点到原点的距离为Xcm滤纸最少要13cm三、纸色谱法的实验条件色谱纸的选择对Rf值相差很小的化合物，宜采用慢速滤纸对Rf值相差较大的化合物，则可用快速滤纸固定相水或甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇或缓冲溶液。（酸、碱）纸色谱法的实验条件展开剂的选择增加展开剂中极性溶剂的比例量，可以增大Rf值；增加展开剂中非极性溶剂的比例量，可以减少Rf值。常用的展开剂水饱和的有机溶剂，如水饱和的正丁醇、正戊醇、酚等操作步骤点样、展开、显色、定性定量分析主要内容：比移值及其与K和k的关系、相对比移值吸附薄层色谱法：原理，吸附剂、展开剂及其选择薄层色谱定性方法纸色谱法：原理和实验条件