第6章 转录后加工

第6章Pre-RNAprocessing6.1原核生物rRNA和tRNA转录后加工6.1.1rRNA转录后加工6.1.1tRNA转录后加工原核细胞rRNA前体的加工6.1.1rRNA转录后加工tRNAIletRNAAlatRNAAsptRNATrp16S23S5SRNaseIIIRNaseIIIRNaseIIIRNaseIIIRNaseRRNaseRRNaseRRNaseRRNaseR图13-rRNA的加工rRNA的加工tRNA的加工分成3个阶段“斩头”：形成5′末端[RNaseP具有内切酶的活性，可切除前体tRNA5′端的前导序列（41nt）]去尾：切除多余的核苷酸形成3′-OH末端。缺-CCA的tRNA要用tRNA核酸转移酶加-CCA修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鸟苷（2mG），TψC臂的假尿苷（ψ）和反密码子环上的2异戊腺苷（2ipA)6.1.2.tRNA的加工6.2Pre-RNAprocessinginEuk.6.2.1概念pre-RNAcappingtailingsplicingmethylationediting生物学意义;matureRNA●preventpre-RNAfromdigestedbyRNaseastemplate(proteintranslation)linterruptedgene(interruptedRNA)moveintrons(stopcodon)6.2.2pre-RNAcappingCap-0m7GpppXpYp-------(共有)Cap-1m7GpppXmpYp-------Cap-2m7GpppXmpYmp-------1、帽子的种类HN—CH3m7G帽子0其中:☆单细胞真核生物只有Cap—0☆Cap—1是其余真核生物的主要帽子形式☆Cap—2存在于某些真核生物中2、帽子结构的生成☆甲基供体都为S—腺苷甲硫氨酸（SAM）☆RNA鸟苷酸转移酶-----戴帽酶（cappingenzyme）3、帽子结构的功能（1）对翻译起识别作用------为核糖体识别RNA提供信号Cap—0的全部都是识别的重要信号Cap—1,2的甲基化能增进识别（2）增加mRNA的稳定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻击（3）与某些RNA病毒的正链合成有关（Cap—1、Cap—2）除帽子结构外的Euk.mRNA内部甲基化－－－m6A形式6.2.3pre-RNAtailing1、3’端-----约长200bp(大多数Euk.的mRNA)（poly(A)+poly(A)-）最近研究发现，原核生物的RNA转录后也有3’添加poly(A)的现象E.coli的poly(A)+聚合酶早在1962年就已发现2、poly(A)的生成a、RNA末端腺苷酸转移酶（poly(A)聚合酶）催化前体－－ATP反应如下：多聚核糖核酸+nATPMg++或Mn++多聚核糖核酸(A)n+nPPib、添加位点内切酶(360KDa)切除一段序列由poly(A)聚合酶催化添加poly(A)内切酶的识别位点（有其它因子参与）切点上游13－20bp处的AAUAAA切点下游的GUGUGUG（单细胞Euk.除外）Proceedingofpre-RNAtailingRecognizingsiteCapCap特异内切酶识别AAUAAA及随后的GUGUGUG并在其间酶切，在3‘端聚合50-200poly(A)GUGUGUG3、poly(A)的功能c、对含poly(A)的mRNA失去poly(A)可减弱其翻译（1）可能与核质转运有关（2）与mRNA的寿命有关（3）与翻译有关a、缺失可抑制体外翻译的起始b、胚胎发育中，poly(A)对其mRNA的翻译有影响（非poly(A)化的为储藏形式）（4）poly(A)在分子生物学实验中有很大应用价值a、也可将oligo(dT)与载体相连，从总体RNA中分离纯化mRNAb、用寡聚dT（oligo(dT)）为引物，反转录合成cDNA6.2.4.RNASplicingPrimarytranscriptTheconsensussequencesforhuman5’splicesite(5’剪接位点):theexon-intronboundaryatthe5’endoftheintron3’splicesite(3’剪接位点):theexon-intronboundaryatthe3’endoftheintronBranchpointsite(分枝位点):anAclosetothe3’endoftheintron,whichisfollowedbyapolypyrimidinetract(Pytract).RNAsplicingmodelsa)groupIofintron(chloroplast&mitochondrial)真核生物细胞器基因，低等真核生物核rRNA基因GroupIIofintron:只见于某些真菌线粒体和植物叶绿体基因hnRNA的拼接：需要剪接体,由核糖核蛋白介导★tRNA基因的内含子均位于tRNA的反密码环上四种内含子的边界序列各有一定共同的特征拼接方式方式一：由拼接装置完成（核mRNA内含子）可供识别的特异序列拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成方式二：自我拼接（两类内含子Ⅰ、Ⅱ）形成特定的二级结构RNA具有催化拼接的能力方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母tRNA）前两种拼接都属于转酯反应b)I类内含子拼接特点(四膜虫35srRNAmodel)●5’---exon----UpA------intron------GpU----exon-----3’高度保守，转酯反应的攻击位点2、拼接机制（以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例）P295（1）两种rRNA转录在一条35S的产物中，26SrRNA有内元5’UG3’小rRNA大rRNA（26S有内含子）（2）35SRNA体外有自我拼接的能力反应需要：一价和二价离子鸟苷酸辅助因子（GTPGDPGMP和鸟嘌呤核苷）不需能量的供给（3）拼接反应后，G与内含子（414base）5’端以磷酸二酯键相连（4）具体的拼接过程第一步：游离G发动的转酯反应G的3’-OH攻击内元的5’拼接点第二步：游离外显子（左）发动的转酯反应左外显子的3’-OH攻击3’拼接点，同时释放线状的内含子,形成成熟RNA分子☻两次转酯反应是紧密偶联的☻释放出的内含子可继续进行转酯反应而形成环状Ⅰ型内含子的自我剪接四膜虫35SrRNA前体的剪接反应是Ⅰ型的典型代表。特点是需要鸟苷参与。●自由鸟苷酸的3`-OH作为亲核基团攻击内含子的5`端的磷酸二酯键，从上游切开RNA链●整个过程不需能量，由RNA自身催化，酶和底物均为RNA，其中的内含子为RNA重排酶，反应本质为二次转酯反应●上游外显子的自由3`-OH作为亲核基团攻击内含子3`位核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子被完全切开。科罗拉多大学Cech等人完成（美）活性位点（4）总结：四膜虫的35SRNA的内含子有自身催化的性质即---将一处已有的磷酸二酯键转变成另一处新的磷酸二酯键，不需要额外的能量因此：内含子可以看作是RNA重排酶（RNArearrangease）或RNA异构酶（RNAisomerase）其中：拼接反应中，“酶”和底物是同一个分子，且反应后变成了不同的分子主要特征：专一性强加快反应速度反应前后酶分子保持不变人们称这种由RNA构成的酶为----核糖核酸酯酶（ribozyme）可简称R酶c)II类内含子拼接特点(Michel1982)拼接点序列7核苷酸的保守序列（BranchSite）3’拼接点上游6bp~12bp处●5’----exon-----GUGCG---------B.S----PyAU----exon---3’供点受点----PyPuPyPyUAPy---100%Ⅱ型内含子的自我剪接不需要鸟苷参与，而由其自身结构决定。特点是形成套索内含子。EcomplexAcomplexBcomplexCcomplex（d）splicesome介导的拼接反应1、相关概念Euk.的细胞中，有许多碱基数在100~300之间的小分子RNA,每个细胞有105~106个snRNA：细胞核中的（snRNP）scRNA：细胞质中的（scRNP）lariafstructure（套索结构）2、核mRNA内含子拼接的结构特点拼接点序列Breathnach-Chambonrule（GU－AG规则）●5’---exon---GU--------intron--------AG------exon----3’●7Ntbranchsite3’拼接点的上游pyXpyUpuApyAssembly,rearrangement,andcatalysiswithinthespliceosomeAssemblystep11.U1recognize5’splicesite.2.OnesubunitofU2AFbindstoPytractandtheothertothe3’splicesite.TheformersubunitsinteractswithBBP(branchpointbindingprotein)andhelpsitbindtothebranchpoint.3.Early(E)complexisformedSplicingpathwaysEcomplexAssemblystep21.U2bindstothebranchsite,andthenAcomplexisformed.2.Thebase-pairingbetweentheU2andthebranchsiteissuchthatthebranchsiteAisextruded(挤出).ThisAresidueisavailabletoreactwiththe5’splicesite.AcomplexAssemblystep31.U4,U5andU6formthetri-snRNPParticle.2.Withtheentryofthetri-snRNP,theAcomplexisconvertedintotheBcomplex.BcomplexAcomplexAssemblystep4U1leavesthecomplex,andU6replacesitatthe5’splicesite.U4isreleasedfromthecomplex,allowingU6tointeractwithU2.ThisarrangementcalledtheCcomplex.BcomplexCcomplexinwhichthecatalysishasnotoccurredyetCcomplex1streaction2ndreaction●第一次转酯－－左外显子、内含子剪切套索lariat●第二次转酯－－exons连接、套索状内含子释放●剪接体（spliceosome）解体与lariat降解同步GinsteadofAalinearintronaLariatintronThreeclassofRNASplicingClassAbundanceMechanismCatalyticMachineryNuclearpre-mRNAVerycommon;usedformosteukaryoticgenesTwotransesterificationreactions;branchsiteAMajorspliceosomeGroupIIintronsRare;someeu-KaryoticgenesfromorganellesandprokaryotesSameaspre-mRNARNAenzymeencodedbyintron(ribozyme)GroupIintronsRare;nuclearrRNAinsomeeukaryotics,organllegenes,andafewprokaryoticgenesTwotransesterific-ation