蛋白质工程

第六章蛋白质工程一、蛋白质工程崛起的缘由例如：改造干扰素（半胱氨酸）体外很难保存干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍满足人类生产和生活的需要蛋白质工程(proteinengineering)：通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质技术1、基因定点突变——定做新蛋白质2、蛋白质设计——对天然蛋白质的修饰二、蛋白质工程的概念1983年，美国生物学家额尔默首先提出了“蛋白质工程”的概念。蛋白质工程的实践依据DNA指导合成蛋白质，因此，人们可以根据需要对负责编码某种蛋白质的基因进行重新设计，使合成出来的蛋白质的结构变得符合人们的要求。人类蛋白质组计划是什么？它与蛋白质工程有什么关系？我国科学家承担了什么任务？人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域一项重大的科学命题。2001年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正式提出启动了两项重大国际合作行动：一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。“人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织／器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔的重大国际科研协作计划，总部设在北京，目前有16个国家和地区的80多个实验室报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础。人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋白质工程的有力推动和理论支持。三、蛋白质工程的基本原理1.从预期的蛋白质功能出发2.设计预期的蛋白质结构3.推测应用的氨基酸序列4.找到相应的脱氧核苷酸序列基因DNA氨基酸序列多肽链蛋白质三维结构预期蛋白质功能分子设计DNA合成蛋白质工程的内容主要有两方面：一是根据需要设计具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质二是确定蛋白质的化学组及空间结构与生物功能之间的关系，在此基础上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生理功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质，而氨基酸排序由基因决定，所以还需要改造控制蛋白质合成的相应基因中脱氧核苷酸序列或人工合成所需要的自然界原本不存在的基因片段，用与蛋白质工程。蛋白质分子的生物功能，与蛋白质分子的结构密不可分。决定蛋白质这种特殊生物功能的关键因素是它的分子构象.2.组成生物体蛋白质的20种氨基酸氨基酸英文氨基酸英文赖组脯苏丝色天冬精LysHisProThrSerTryAspArgLysineHistidineProlineThreonineSerineTryptophanAsparticacidArginine谷缬半胱丙亮酪甲硫(蛋)GluValCysAlaLeuTyrMetGlutamicacidValineCysteineAlanineLeucineTyrosineMethionine甘苯丙GlyPheGlycinePhenylalanine谷酰天冬酰异亮GlnAsnIleGlutamineAsparagineIsoleucine蛋白质工程的内容主要有两方面：一是根据需要设计具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质二是确定蛋白质的化学组及空间结构与生物功能之间的关系，在此基础上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生理功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质，而氨基酸排序由基因决定，所以还需要改造控制蛋白质合成的相应基因中脱氧核苷酸序列或人工合成所需要的自然界原本不存在的基因片段，用与蛋白质工程。第二节蛋白质工程的基本步骤与改造策略一、蛋白质工程的基本步骤(1)分离纯化目的蛋白，使之结晶,进行分析,得到其空间结构的尽可能多的信息。（2）对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域。（3）通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系分析，找出关键的基团和结构。(4)围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实施。(5)对经过改造的蛋白质进行功能性测定.二、蛋白质工程的改造策略1、疏水氨基酸常常出现在蛋白质的活动中心区域；α螺旋和β折叠区通常不会是酶的活性中心以及底物结合的中心，而是作为结构的支架；环区、转角区域和带电荷区域通常位于蛋白质的表面。2、进行定点突变时，应注意保守氨基酸残基。如果要改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的性质，则应尽量保留保守残基。3、应注意保留潜在的N糖基化位点(Asn-X-Ser／Thr-X-Pro)中的Asn(天门冬酰胺)、Set(丝氨酸)或Thr(苏氨酸)。4、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白其余部分的正确折叠。5、构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当两个非同源蛋白组成嵌合体时，则应使接合部分尽量位于所预测结构的边缘。6、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那么可以在目的序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域。插入六聚体接头后，在原蛋白质序列中添加两个氨基酸，比插入更多的氨基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻。7、进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。第三节、蛋白质改造方法在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规模和程度可以分为：初级改造：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入高级改造：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接从头设计合成新型蛋白质一、初级改造通过基因突变方法，以达到改变氨基酸进而改造蛋白质的目的。目前，主要采用的基因突变方法：基因定位突变盒式突变。基因定位突变根据三联体密码，编码DNA（目的基因）的确定位点，改变其组成核苷酸的顺序或种类，使基因发生定向变异，使其控制合成的氨基酸种类、顺序发生改变，合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。基因定位突变的基本过程：首先使目的基因由环状载体折成单链，再对指定的位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生定位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统(如大肠杆菌等)即可产生突变体蛋白质。这是目前定向改造蛋白质的基本手段。蛋白质工程举例：定点突变技术：已知丝氨酸是由TCT编码，只要把C改为G，就变成半胱氨酸的密码TGT。于是用人工合成一段寡聚核苷酸引物，引物里含有TGT外，其余均与基因部分互补。打开含有被突变蛋白质基因的质粒的双条链成单链模板，用引物与之互补链退火（假如退火在适宜温度下进行，约15个碱基中，有一个碱基错配是可以容忍的）。然后由DNA聚合酶延伸引物，由DNA连接酶将双链再连接成环，转入宿主细胞复制，即产生两种子代质粒。一半的顺序中含有TCT顺序，另一半含有TGT顺序。表达具有TGT顺序的质粒，即可以产生在同一部位上半胱氨酸代替丝氨酸的蛋白质。二、蛋白质工程的一般技术1、蛋白质工程的理论设计——蛋白质工程的前提2、点突变法——基因修饰的方法（1）基因的全化学合成（2）基因直接修饰法（3）盒式突变技术三、蛋白质工程的应用1、蛋白质工程酶—酶特性的改造（1）改变酶的催化活性（2）改变酶的底物专一性（3）提高酶的稳定性（4）酶的反应特性改变（5）产生新酶2、合理药物设计—蛋白质工程用于新药研制譬如：胰岛素原的人工合成三、蛋白质工程的应用1、蛋白质工程酶—酶特性的改造（1）改变酶的催化活性（2）改变酶的底物专一性（3）提高酶的稳定性（4）酶的反应特性改变（5）产生新酶2、合理药物设计—蛋白质工程用于新药研制譬如：胰岛素原的人工合成胰岛素原的人工合成胰脏(A)n胰岛素原mRNAcDNA重组质粒转化细菌mRNA反转录酶胰岛素原基因与质粒连接感染E.coli胰岛素原第四节蛋白质工程在食品中的应用提高蛋白的稳定性包括以下几个方面：①延长酶的半衰期；②提高酶的热稳定性；③延长药用蛋白的保存期；④抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的应用前景。一、消除酶的被抑制特性1985年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位突变技术，用19种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第222位残基上易氧化的Met，获得了一系列活性差异很大的突变酶。发现除了用Cys代替Met的突变体以外，其他突变体的酶活性都降低了。二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性溶菌酶分子：由一条肽链构成，并在空间上折叠形成二个相对独立的结构域，酶活性中心位于二个结构域之间。该酶分子在第97位和54位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸由于二硫键是一种稳定蛋白质分子空间结构的重要共价化学键，有如建筑所用的钢筋一样，因而能将分子中的不同部位牢固地联结在一起。因此，提高酶热稳定性最常用的办法是在分子中增加一对或数对二硫键。在高温下Asn和Gln容易脱氨形成Asp和Glu，而导致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有2个Asn，由于它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决定性作用。通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第14位和第78位上的2个Asn分别转变成Thr(苏氨酸)和Ile(异亮氨酸)残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。三、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性四、改变酶的最适pH值条件葡萄糖异构酶最适pH为碱性，在80℃稳定，而在碱性条件下，80℃时使高果糖浆焦化产生有害物质，反应只能在60℃进行。采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中的区域置换为碱性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖异构酶的最适pH值变为酸性，即可在高温下进行反应五、提高酶的催化活性酶的催化活性由酶分子上的必需基团决定如对酪氨酸-tRNA合成酶进行定点突变在天然状态下，酪氨酸-tRNA合成酶分子内第51位苏氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环上的氧原子形成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与另一底物ATP的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶分子第51位苏氨酸残基改变为脯氨酸残基，酶(Pro-51)与ATP的亲和力被增加了近100倍，而且最大反应速度亦大幅度提高。六、修饰酶的催化特异性利用定点突变技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代时，突变体酶分解α-1，4糖苷键和α-1，4糖苷键的活性比例发生明显改变七、修饰Nisin的生物防腐效应Nisin是乳酸球菌分泌的有较强抗菌作用的小分子肽，可用于罐头食品、乳制品、肉制品的保藏Nisin由34个氨基酸残基构成改变Nisin氨基酸的序列，可增强其稳定性、溶解度和扩大抑菌谱等，扩大Nisin的应用范围。Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸，即ABA、DHA、DHB、ALA-S-ALA和ALA-S-ABA，它们通过硫醚键形成五个内环。思考题1、什么是蛋白质工程?蛋白质工程基本步骤有哪些?2、改造蛋白质的方法有哪些?3、简述蛋白质工程技术在食品工业中的应用。