如何获得理想的衍射数据1_STU 蔡继文

X-raydiffractionDrivingX-rayinnovationCommercialinConfidence安捷伦科技有限公司生命科学部严子耳蔡继文如何获得理想的单晶衍射数据AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidence引言:一些基本概念第一部分：数据收集第二部分：数据还原AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidenceSolvethestructureCollectdataX-rayDiffractometerchemistryjudgement+12X-raysSinglecrystalDiffractionpattern研究对象：一切可以结晶的物质CommercialinConfidence什么是晶体?•晶体就像作左图中有序堆积的橙子•每个橙子就是一个分子•一组橙子可以组成一个重复单元（即晶胞），结合对称操作可以用此组橙子来描述整箱橙子•晶体即是此重复单元在三个维度上的堆积•因此晶体是长程有序的结构UnitcellAgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidence单晶衍射仪的组成测角仪-晶体定位平台CCD检测器-特殊设计的数码相机-拍摄X射线照片X射线源-产生X射线AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidenceSchematicCCDconstructionBerilliumwindowScintillatorFibre-optictaperCCDPeltiercoolingElectronicsConvertsToGreenlightConvertstoElectronicsignalCommercialinConfidence衍射实验通过数据还原获得衍射点的位置(hkl)和强度(intensity–I)。例如：HKL;I-124;3678-202;235412-4;3496X-rays衍射晶体大小0.5mm在晶体不同的取向上收集一系列的衍射照片AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidence结构解析Cycle2:R1=11.28%Cycle3:R1=8.49%Cycle4:R1=7.21%Cycle5:R1=5.73%(finalrefinedstructure)已收到的衍射点：HKL;I-124;3678-202;235412-4;3496如何解析和精修晶体结构AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidence实验结果能揭示什么?小分子蛋白质晶体结构活性位点的形状和化学结构蛋白质的三维结构/折叠120°精确的键长键角数据三维结构AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidence确定分子立体结构•是确定新的无机和金属有机化合物结构的主要技术•越来越广泛应用于有机物的结构尤其是立体结构的确定•有机物/天然产物/药物分子的绝对构型确定确定分子结构参数•键长+/-0.001A•键角betterthan0.1度•扭曲角0.1度研究化学键性质理解固体化合物性质•建立构效关系•变温/变压实验理解相变/热膨胀和其他物理性质的分子基础ChemicalCrystallography化学晶体学CommercialinConfidenceMacromolecularCrystallography生物大分子晶体学ProteinShapeandchemicalstructure(specificity/activity)ofactivesite3-Dstructure/folding结构生物学基于结构的药物分子设计•蛋白质分子的三维结构，折叠模式•为药物分子设计提供蛋白质分子的结构模型CommercialinConfidenceTheImportanceoftheTechniqueBestillustratedby23NobelPrizewinnersassociatedwithX-raycrystallographyfrom1901(Physics,discoveryofX-Ray,W.C.Röntgen)to2006(chemistry,studiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription,R.D.Kornberg)1901至2006年间共有23个诺贝尔奖与该技术有关Onemorein2009!CommercialinConfidenceTheImportanceoftheTechnique•几乎所有主要的大学至少有一台单晶衍射仪，南开大学/吉林大学/中山大学〉5台•每年有超过10万个晶体结构被确定，其中只有少部分结构被发表(新结构）•50%以上的无机和金属有机化学文献至少报道一个新的结构CommercialinConfidence单晶结构分析已经成为一种常规和快速的分析技术•硬件的进步更亮的光源，更快的检测器快速而经济的IT技术•软件的进步成熟的结构解析和精修方法免费的结构解析和精修软件Olex2,WinGX,Crystal…小分子晶体的数据采集和结构精修过程由70年代的几个月/80年代的几天/90年代的几小时，缩短到现在的几分钟到几十分钟！TheImportanceoftheTechniqueCommercialinConfidence第一部分如何收集一套高质量的数据…AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidence从生长“好”的单晶开始JAgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidenceCrystallization–SmallMolecule•evaporation–openbeaker…溶剂挥发•Solvent/vapourdiffusion扩散ABAB(a)(b)o结晶的关键是通过溶剂挥发／引入溶解度较小的溶剂／冷却等方法慢慢达到饱和和超饱和状态morepolarsolventlesspolar一些成功的溶剂组合：CH2Cl2/etherorhexaneEtoAc/etherorhexaneAcetone/hexaneMethanol/etherorTHFWater/ethanolDMSO/water两种溶剂的极性不能太接近，也不能差异太大CommercialinConfidenceCrystallization•Geldiffusion凝胶扩散AnefficientwayofobtaininglesssolubleorganometalliccrystalviadiffusingthemetalandligandviathegelLMMLLM(a)(b)(c)CommercialinConfidenceCrystallization水热和溶剂热方法（高温高压）•Growlowsolubilitycrystal•Employpressurevessel•WorkwellforhybridsolidsCommercialinConfidenceCrystallization-Proteinvapordiffusion•hangingdrop,consumemoreproteinsample•sittingdrop,lesssample,goodforscreeningMicrodialysisProteindropOilOilReservoirbufferproteindropReservoirbufferDialysismembrane10mm10mmTopview6mmProteinsolutionSideview'0'ringtokeepmembraneinplaceCommercialinConfidenceHowtoselectthecrystal?•Shape:needle,plate,orblock?晶体形状并不重要•Singularityveryimportant!Nointer-growncrystal.重要的是‘单’晶CommercialinConfidenceHowtoselectthecrystal?大小受吸收和光斑大小的限制，不一定是越大越好通常大小为0.1-0.3mm直径，取决于晶体的组分和光源强度含有金属的化合物或使用铜光源时，晶体可以小些；有机化合物晶体或使用钼光源时，可以大些衍射能力晶体衍射能力弱可能是由于无序／晶体缺陷或晶体风化引起的，根据晶体外观很难判断通常建议从同一批晶体中选出三颗晶体，通过衍射仪初试实验选出衍射能力最好的样品CommercialinConfidence找到最“棒”的晶体先留意以下问题:•对空气/水气敏感?•易风化?•易碎?•对光敏感?•是否有已知的相变?•可能是孪晶或多晶?AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidence在光学显微镜下观察AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidence在光学偏振显微镜下观察AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidenceSmallmoleculeGlassfiber/Glue/grease/inertoil(Paratone-N)室温：胶低温：油/脂Protein,andsmallmoleculeNylonloop专用尼龙套Goniometerhead载晶座及调节工具安装晶体CommercialinConfidence上样工具AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidence油和胶水:低温实验：油•Fomblin（全氟聚醚油脂）•Paratone室温实验：胶水•Araldite(2partepoxy)AB胶•Superglue强力胶水AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidence一些建议提前准备好您的样品和所需工具等。使用洁净的上样工具，避免污染。尽可能将样品分为多份，以方便多次尝试。选择好适用的油—快速均匀地与晶体混合（低温实验）。尽量使用冷光源照明，以延长晶体挑选时间。请先了解您所用的显微镜的放大倍率和衍射仪的光斑大小，并照此挑选晶体样品。—请记住，常常小晶体的质量会更好。挑选面/角清晰的晶体；避免挑选有裂缝和表面有缺陷的晶体；从簇状或薄片状晶体中分离出单颗晶体（小心处理以免损坏晶体）。将挑选好的晶体转移到合适的上样工具上—尽量少裹油、尽量减少样品转移到衍射仪上的时间、尽量减少在转移过程中对晶体的损坏。对心—确认晶体处于低温气流中，并通过一幅衍射照片来快速评估晶体质量。AgilentRestrictedJanuary29,2020CommercialinConfidenceAbouttheX-raysource双光源系统提供Mo(0.7107Å)和Cu(1.5418Å)光源可以根据具体情况和需要选择光源–常规结构测定，尤其是含有重金属的晶体结构测定通常使用Mo光源–蛋白质晶体结构分析/有机物/不含重原子的有机物绝对构型测定/小和弱的衍射体，使用Cu光源CommercialinConfidence铜光源和钼光源•Cu光源的散射强度=6-10倍Mo光源•所以60秒Mo光源的数据收集≈10秒Cu光源数据收集•Cu光源对测试小或散射弱的晶体有很大的帮助。•但是.