第2章 细胞培养的设备和操作技术

细胞培养的设备和操作技术第二章主讲内容实验室的设计和基本操作技术培养基及其配制第一部分实验室的设计细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备（培养基配制，洗涤与灭菌）；无菌操作；控制培养。从总体上来分，实验室主要分为两类：基本实验室：辅助实验室：实验室设计1、基本实验室：准备室接种室培养室作用植物细胞和组织培养所需器具的洗涤、干燥和保存；培养基的配制、分装和灭菌；化学试剂的配制；重蒸馏水的生产等。设计要求面积20m2左右。通风透光，地面防滑，墙面防潮。准备室▲实验台架▲大、小水槽▲烘箱▲冰箱▲天平系列▲pH计▲高压消毒锅▲各种玻璃器皿▲药品柜▲（磁力）搅拌器▲电炉▲蒸馏水器设备其中：玻璃器皿包括三角瓶、试管、培养瓶、培养皿、烧杯、量筒、移液管等移液枪（根据条件需要）由枪和枪头组成其他：锅、微波炉等磁力搅拌器电子天平万分之一百分之一pH计微量移液器蒸馏水器－80℃－40℃0～4℃各式冰箱接种室——也叫无菌操作室•无菌操作室并非无菌，但应该保持清洁作用供外植体的接种，培养物的转移和原生质体的游离培养操作之用。无菌室设计要求墙壁光滑平整，地面平坦无缝，除出入口和通气口外，应当密闭，空气不能对流，或者空气经净化后进入室内。无菌室旁边应设有缓冲间，缓冲间内应有紫外灯，随时可进行灭菌。无菌室内的日常灭菌：定期用甲醛和高锰酸钾混合后熏蒸，产生大量蒸汽，杀灭微生物。使用前处理：用新洁尔灭（1：50）擦净，然后用紫外灯照射灭菌至少20分钟，操作前用70%酒精喷雾。思考：紫外灯如何杀菌？操作中要注意什么？设备△紫外光灯△空调△放物架（或医用小平车：推送、放置培养基用；）△无菌操作用的器具：酒精灯、70%酒精消毒棉、解剖刀、弓背镊子、解剖针、剪刀等。△超净工作台：内设紫外灯、吹风装置、过滤装置等每次实验前要用紫外灯灭菌20分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。其它部件：△离心机：分离原生质体用；△点融合仪：细胞融合用。3培养室离体组织和试管苗生长发育的场所，应为培养物创造适宜的温、光、气等条件。设计要求培养室内要求内壁保温、光滑、室顶高2.6m左右，易于控制温、湿度，窗上要求装双层密封玻璃窗，室内有足够电源。作用设备△空调机：冷暖型△加热器△定时装置：控制光照时间△培养架：放置培养瓶△摇床和转床：悬浮培养△各种光质灯管：光照培养△温度计：控制温度△遮光帘：供暗培养之用2、辅助实验室：细胞学实验室摄影室及暗室生化分析室细胞学实验室主要设备各种显微镜，显微照相设备，切片、制片仪器设备，染色用具，暗房设备等。作用植物组织和细胞培养过程中，需随时观察记录其细胞学和形态解剖学的变化，故要设置细胞显微观察室。荧光显微镜相差显微镜倒置显微镜普通显微镜理化分析试验室细胞工程实验室基本设备配制小结基本设备：冰箱、天平、酸度计灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。无菌操作设备：净化工作台、接种箱光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜第二部分基本操作技术基本操作技术主要是围绕无菌操作技术展开的一系列操作技能，内容主要包括：一．洗涤技术二．灭菌、消毒技术三、接种技术一、洗涤技术、洗涤目的：去除杂物，降低带菌量、根据洗涤对象的不同，主要分为：器皿洗涤（包括玻璃、塑料、搪瓷、不锈钢器皿）培养材料洗涤（一）器皿洗涤根据洗涤对象的具体情况可分为以下三种：特殊洗涤微生物大量污染的洗涤常规洗涤常规洗涤△自来水洗去油渍、霉菌等脏物；△温肥皂水中浸泡一定时间后用刷子刷净；△自来水冲洗干净，至瓶壁不挂水珠为止；△蒸馏水淋洗内外壁△将玻璃器皿倒置：晾干或烘干（50～75℃）△放入除尘柜中备用微生物大量污染的洗涤△微生物污染器皿加压灭菌后再洗涤特殊洗涤（如沾有蛋白质类物质或其它有机物时)△经过常规洗涤未过蒸馏水的器具，浸泡入洗液（铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成）中数分至数小时；△回收洗液，器具先用自来水洗净，蒸馏水淋洗，烘干（75℃）（二）、试验材料的清洗清洗目的：来自自然界的试验材料，包括来自土壤中的幼茎、磷茎，滋生着各种微生物，尤其是细菌的芽孢和真菌的孢子，一旦与培养基接触，就会很快的繁殖起来，造成培养基和培养材料的污染。清洗方法：先用自来水冲洗5分钟，然后用中性洗涤剂清洗，注意勿损伤试验材料。再用自来水流水冲洗半小时，用于下一步的药剂灭菌。二、灭菌、消毒技术（一）关于有菌和无菌的概念有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。高压高温处理（工具、器皿、培养基等）物理或化学处理；火烤后的物体；健康的动植物不与内外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）无菌的范畴：（二）灭菌、消毒技术作用和意义植物组培中，凡用于培养和无菌操作的房间、器具、培养瓶、培养基，培养材料和操作者的衣物和手都应随时进行灭菌，以确保不受杂菌污染，否则，由于杂菌的生长繁殖速度一般都比培养的组织快得多，最终将把组织全部杀死，这些污染微生物还可能排泄对植物组织有毒的代谢废物，因此在培养容器内部保持一个完全无菌的环境是绝对必须的。（三）灭菌、消毒种类物理方法：物理灭菌：高温高压灭菌（干热/湿热）、烘烤或灼烧灭菌、射线处理、超声波等物理除菌：过滤（0.1微米、0.22微米、0.45微米、0.8微米等）、离心沉淀等；化学方法：使用灭菌剂，如薰蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新洁尔灭、次氯酸钠、过氧化氢）消毒、灭菌的对象：★接种室★材料（外植体）：完全杀死材料表面的微生物过程：洗洁精→酒精→氯化汞等★器皿用具消毒（灭菌）★培养基（三）、培养基、器具的灭菌用灭菌锅灭菌：一般121℃，灭菌20分钟。自动锅：加足水后，调好时间、温度、即可自动运转。手动锅:加足水后，关好，通电。待压力升到0.5kg／c㎡时，打开排气阀排除锅内的冷空气。然后关闭排气阀，升至1.1kg／c㎡(121℃左右)时计时，用通电、断电来保持20分钟。待降至压力为0时取出。器具的灭菌：也可用烘箱160℃，90～120分钟（四）、过滤除菌培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些激素GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌或者两者结合。另外酶等也需要过滤灭菌；灭菌方法：将激素或酶配成一定浓度，用注射器过虑，0.2－0.25微米。配制培养基时，先将培养基高压灭菌，待温度降至50℃左右时，加入适量的已过虑除菌的激素等，然后分装。（五）、外植体的选择与消毒：1、外植体的选择选择优良的基因型：蔬菜等作物、花卉等观赏植物等的脱毒快繁选优良种。取材：从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母株代谢旺盛期取的外植体再生能力强，试验容易成功。外植体大小选择：如利用茎尖培养，脱毒快繁，茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，胚龄也非常重要。选择外植体的时期2、外植体的消毒：取材将老的组织去掉自来水冲洗洗衣粉水洗（简单杀菌）自来水冲洗70％酒精处理消毒剂处理灭菌蒸馏水冲洗3－5遍。消毒时间，因材料老嫩程度不同有所不同。一般，较老的材料相对杀菌时间较长，反之，较短。一般杀菌，酒精10秒，升汞5－12分钟。•外植体在接种之前，须经严格的灭菌，同时又要注意不损伤外植体。不同灭菌药剂杀菌力不同，故在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间，对不同植物种类的不同外植体，处理也有不同。•另外，外植体在进入消毒剂之前，应认真取材及清洗，尽可能地减少其带菌量。外植体除菌注意事项：消毒剂使用浓度(％)消毒时间(分)效果残液去除难易次氯酸钙105～30好易次氯酸钠2～55～30好易新洁尔灭10～205～30好易氯化汞0.1～12～10最好最难过氧化氢10～125～15较好最易抗菌素4～50mg/L30～60较好较难几种常用消毒剂的效果比较附：常用消毒剂的性质70～75％酒精：具有较强的穿透力和杀菌力，常作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和灭菌的双重作用，但不能彻底灭菌，必须结合其他药剂灭菌。一般处理时间为5～30s。为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1％的酸或碱，因为H+和OH-可改变细胞膜带电荷的性质而使透性增加，提高杀菌的效果升汞（HgCl2）：剧毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是Hg2＋与带负电荷的蛋白质结合，使菌体酶蛋白变性失活。使用浓度0.1～0.2％，一般浸泡处理6～12min就可有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌，灭菌效果极好。但用升汞灭菌的外植体材料须用无菌水反复多次冲洗，才能洗去残留的汞，否则会对外植体产生毒害作用。通常用无菌水冲洗不得少于5次。由于升汞的毒性剧烈，使用中务必注意安全。升汞废物的处理升汞为剧毒药品，一则使用时注意别溅到皮肤上；二则使用后要进行处理，不能直接倒入下水道。升汞处理方法：升汞＋Na2S絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）＋FeSO4（中和过多的Na2S）次氯酸钠（NaClO）：用市售的“安替福民”配制2～10％的NaClO，灭菌时间5～30min，无菌水冲洗4～5次。由于它分解出具杀菌作用的氯气，灭菌处理后易于除去，无残留，既有较强的杀菌力，又对植物无害，是常用的杀菌剂。过氧化氢（双氧水）：常用6～12％的溶液处理外植体材料，灭菌效果较好，由于该药剂在外植体表面容易除去，又不会损伤外植体，通常用于叶片材料的灭菌。新洁尔灭：一种广谱的表面活性灭菌剂，它对绝大多数植物外植体伤害很小，灭菌效果很好。通常使用1：200稀释液，处理30min或更长。在用上述药剂进行材料的灭菌处理时，为了使杀菌剂湿润整个组织，有时还需在药液中加入润湿剂。如加入数滴或0.1％的吐温（Tween）80或吐温20，或者用磁力搅拌、超声振动等方法使杀菌剂充分接触外植体，以利于彻底灭菌。三、接种技术1所有的消毒、接种等无菌操作技术均需在无菌室的超净工作台上进行。1、超净工作台：内设紫外灯、吹风装置、过滤装置等，每次实验前要用紫外灯灭菌20分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。2、无菌操作用的器具：刀、镊子、剪刀、酒精灯等事先已灭菌，使用中避免交叉污染；3、操作人员在操作之前洗手、换工作服、双手消毒再操作。•培养条件光照:光照强度、光质、光照时间温度湿度pH值：5.5～6.5渗透压通气条件根据离体培养的营养需求，培养基至少包括：无机盐；有机化合物；生长调节剂三、培养基及其配制培养基的基本成分Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、B1无机营养物质、大量元素：C、H、ON、P、K、Ca、Mg、S、(Na)、微量元素：无机盐的作用：一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的代谢活动；三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用；四是在发育过程中，影响组织器官的建成。浓度：2%-3%2有机物质糖：作用：维持培养基合适的渗透压为细胞提供合成新物质的碳骨架为细胞的呼吸代谢提供底物和能量种类：蔗糖、葡萄糖麦芽糖、果糖等多糖：可溶性淀粉维生素：硫胺素(VB1)、烟酸（VB3又称VBPP）、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、酸铵、钴胺素(VB12)、叶酸(VM又称VB11)、抗坏血酸(VC)等等.作用：利于细胞代谢和器官分化。B1是植物组培必须加入的维生素，其用量在0.1-30mg/L之间，当组培中细胞分裂素特别少时，B1更为需要；烟酸和B6可促进细胞生长氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不同，其添加种类和浓度不