第二组-构建未知蛋白基因工程及其研究项目

构建未知蛋白基因工程及其研究项目制作：邵世鹏四川大学化工学院制药与生物工程系小组成员•方成富•邵世鹏•黄锐•程新成•王森•周铁柱•林立•向臻•柳帆•卢静•李应党(排名不分先后)如何才能做好这个课题？花足够的时间用心去做赖祖亮@小木虫赖祖亮@小木虫问题对某种其结构一无所知的蛋白质，如何获得其cDNA？试写出你的操作构想，并写出从cDNA的获得到工程菌构建整个过程的操作步骤及其所涉及到的技术或方法，实施过程中需要进行哪些方面的研究？为何要进行这些研究？如何进行研究？难点分析及对策•本题中的主要难点为蛋白质未知，其编码序列亦不可知，无法准确获得目的基因。因此，欲获得目的基因，必须先对目的蛋白进行研究以获得足够的信息可以推断DNA序列。•目的基因的获取是所有操作中最为困难的一步，其成功与否关系到整个工程的成败。•采用逆向中心法则的办法，有蛋白质的氨基酸序列倒推编码它的DNA序列。以此作为引物去钓取mRNA,由RT-PCR法反转录成cDNA并进行扩增.但由于密码子的简并性，由蛋白质到DNA的序列不唯一，故应该合成系列引物。中心法则DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录本题思路（逆向）主要框架NO。03NO。02NO。01由未知蛋白质获取目的基因构建未知蛋白表达的工程菌实验操作的探究原因及方法123三步走战略主要操作步骤预览选择细胞细胞培养细胞破碎提取RNA分离总mRNART---PCR合成引物电泳酶切连接转化筛选工程菌培养细胞提纯蛋白质蛋白质测序合成寡聚引物性质研究主要框架NO。03NO。02NO。01由未知蛋白质获取目的基因构建未知蛋白表达的工程菌实验操作的探究原因及方法123三步走战略之一RT-PCR定向扩增获得目的基因的cDNA从目的细胞中提取总mRNA合成系列简并引物以用于定向扩增未知蛋白质理化性质及序列测定未知蛋白质的提取获得获取目的基因构建工程菌拓展探究蛋白质性质研究及测序第一步第二步第三步第四步测分子量测等电点测序引物合成定向扩增测定相对分子质量重要性测量方法相对分子质量是蛋白质的重要性质，由它可以推测出组成氨基酸的多少，从而可以大致推断出编码该蛋白质的核苷酸的多少，便于以后的PCR扩增产物检测。测定未知蛋白质的相对分质量常用聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）。与标准的对比参照物相互比对，可以比较准确的侧得相对分子质量测分子量测等电点测序引物合成定向扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳简介•在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值•在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质－SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计测分子量测等电点测序引物合成定向扩增电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品带孔胶电泳方向电泳小分子大分子测定原理测分子量测等电点测序引物合成定向扩增当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的自然对数值呈反比，符合下列方程：lnMr=－bmR+K式中：Mr为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。在条件一定时，b和K均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。测分子量测等电点测序引物合成定向扩增测定原理标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。相对迁移率测分子量测等电点测序引物合成定向扩增【操作方法】将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上，灌注胶液。二试剂体积H2O3.35（ml）凝胶贮备液2.5（ml）分离胶缓冲液(pH8.8)2.5（ml）10%SDS0.1（ml）TEMED5（ul）10%过硫酸铵50（ul）总体积10（ml）一、装板二、分离胶的配制（12%测分子量测等电点测序引物合成定向扩增【操作方法】用移液管将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩胶，然后加满蒸馏水。待分离胶凝固后，倒出蒸馏水，用滤纸吸干。试剂体积H2O2.92（ml）凝胶贮备液0.8（ml）分离胶缓冲液(pH6.8)1.25（ml）10%SDS0.05（ml）TEMED5（ul）10%过硫酸铵25（ul）总体积5.05（ml）三、分离胶的灌注和聚合四、浓缩胶的配制（5%）测分子量测等电点测序引物合成定向扩增用移液管将所配制的浓缩胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，将梳子插入胶液顶部，放置室温下待其聚合。七、加样六、样品的准备在低分子量标准蛋白质和待测样品中分别加入适量还原缓冲液，放入沸水浴中加热3~5min，取出冷至室温。五、浓缩胶的灌注和聚合加入电极缓冲液，小心拔出梳齿，用微量注射器向凝胶梳孔内加样。同时加入Marker。【操作方法】测分子量测等电点测序引物合成定向扩增上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始时，电压控制在不高于100V，样品进入分离胶后，电压控制在不高于140V。待指示剂染料靠迁移至下沿1～1.5cm处停止电泳。十、相对分子质量的计算九、染色和脱色小心将胶取出，放入一大培养皿中。染色：加入染色液，置于摇床上染色2h。脱色：染色完毕，倒出染色液，加入脱色液，置于摇床上脱色，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰，拍照。八、电泳量出分离胶顶端距溴酚蓝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与分离胶顶端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR【操作方法】以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上计算出其分子量。相对迁移率mR蛋白质样品距分离胶顶端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距分离胶顶端距离(cm)=测分子量测等电点测序引物合成定向扩增测定等电点原理测量方法蛋白质是一种两性电解质。在溶液中存在下列平衡。其解离状态和程度爱溶液的pH值影响。当溶液的pH达到一定数值时，会导致蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，此时，蛋白质不移动，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。等电点时，其溶解度最小。1.取4支洁净的试管，按表顺序分别精确加入各试剂，然后混匀。2.向上述试管中各加入酪蛋白的醋酸钠溶液1ml，随加随摇。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。混浊度以‘＋’的多少来表示。沉淀最多的一管即为酪蛋白的等电点。判断其等电点。测分子量测等电点测序引物合成定向扩增蛋白质测序原理蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级结构的信息也有助于对其基因结构的研究。目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即：①氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来；②正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍采用，可以从蛋白质和多肽的N端进行裂解，也可以从C端进行分析。第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色谱进行分离分析。本章将就蛋白质和多肽的N端、C端氨基酸序列分析的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。测分子量测等电点测序引物合成定向扩增•蛋白质和多肽的自由α—氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试•剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容•易断裂。在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的第二个氨基酸残基暴露出自由的α—氨基，又可与PITC进行耦联反应。测分子量测等电点测序引物合成定向扩增【操作方法】一、耦联二、裂解ATZ—氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液(25％)中可转化成稳定的PTH—氨基酸。可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广泛应用于PTH—氨基酸的鉴定。通常选用C—18反相柱进行分离。测分子量测等电点测序引物合成定向扩增【操作方法】三、转化四、PTH—氨基酸的鉴定测序要求•本次实验中我们不需要将未知蛋白的全序列测定出来，这完全没有必要。只需要测定蛋白质的上下游C端和N端约10个左右的氨基酸均可。然后以此氨基酸序列为蓝本进行简并引物设计即可。测分子量测等电点测序引物合成定向扩增简并引物的设计•一种氨基酸（AA）可以由数种核苷酸编码这称为遗传密码子的简并性。从核苷酸到氨基酸只有一种对应方式，而从氨基酸到核苷酸可以有多种可能的组成方式。组成蛋白质的氨基酸共有20种，而三联体密码子的组合方式共有64种，除去三个终止密码子不编码氨基酸，这对引物的设计带来了麻烦。•不同种生物甚至同种生物的不同蛋白质编码基因对简并密码子的使用频率并不相同，存在偏好型。因此我们设计引物的时候要充分考虑到各种密码子的使用状况，综合各种可能结构，并使之有一定的含量比例，以便可完全实现对未知蛋白编码序列的定向扩增。•原因：生物体基因组的碱基数量密码子与反密码子作用的自由能细胞内的tRNA的含量测分子量测等电点测序引物合成定向扩增引物的要求长度合适组成适宜典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。测分子量测等电点测序引物合成定向扩增注意细节一避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。二避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。三避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。.测分子量测等电点测序引物合成定向扩增目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。所合成的引物要完全能够覆盖所有的可能序列，以便未知目的蛋白的任何序列具有可能被扩增。高效引物设计软件酶切位点完备性测分子量测等电点测序引物合成定向扩增Primer4.0Premier5.0生物软件网化学合成法的应用作为核苷酸序列分析（测序）的引物核苷酸杂交（DNA或者ＲＮＡ）的探针较小基因的全合成或者用作基因的组成元件用于基因定点诱变的研究工作用作PCR扩增反应的引物测分子量测等电点测序引物合成定向扩增核酸化学合成的概况•1979年在science上发表文章《一个基因的合成》•是指在体外的条件下，完全通过化学反应合成出具有一定长度且具有特定的核苷酸序列的寡聚核苷酸片段。•现在很多合成方法已经日趋成熟，可以在