03 DNA的复制

DNA复制(DNAReplication)第一节DNA复制的基本特征DNA复制亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。●复制子（Replicon）；又称复制单位或复制元AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminatorDNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位1.3万～90万不等●复制体（Replisome）Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同动作合成DNA一、DNA的半保留复制（Semi-ConservationReplication）1958Meselson-stahl设计的CsCl超离心试验证实了DNA复制的这一特性概念：复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子Semi-conservativeConservativeDispersive中国科学院上海生化与细胞所2002年招收硕士研究生分子遗传学入学考试：请设计一个实验来证明DNA复制是以半保留方式进行的（8分）。实验证据（1958Meselson和Stahl）：MatthewMesselsonFranklinStahl15N标记实验·细胞生长在15N标记培养基中·转入正常N源培养基中·分离各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N标记DNACsCL密度梯度离心浮力密度N15－DNA1.742g/mlN15－N14－DNA1.717g/mlN14－DNA1.710g/ml二、子链DNA延伸方向只能是5’－3’已知的DNA聚合酶只能使链按5’－3’方向生长5’OHTCATCAC5’OH3’pppOHC++ppi进化中保留的深刻的选择与适应的、化学及功能的根源如果DNA的延伸方向是3’→5’ATCG+5’pppOH3’GpppOHGATCG5’pppOH3’ATCG+5’pppOH3’GpppOHG5’pppa、因能量的需要，DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNacl的生理环境中，使dNTP难以聚合到DNA的5’端需要其他机制以解脱b、碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗ATCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘三、DNA复制的半不连续性事实上没有发现DNA能按3’→5’合成的证据先导链按dUMP片段连续复制后随链按Okazaki片段不连续复制先导链（leadingstrand）：DNA复制时，与复制叉向前移动的方向一致，以3’→5’链为模板，按5’→3’方向连续合成的一条链后随链（laggingstrand）：冈崎片段(Okazakifragment):DNA复制不连续合成链中形成的短DNA片段冈崎片段（Okazakifragment）1968E.coli[t-]2’’,7’’,15’’,30’’脉冲标记dT-H30℃KCN杀死D.S.DNAS.S.DNA蔗糖密度梯度离心测定H3-T放射强度脉冲追踪20℃indT-H330’’转移到正常培养基中H3-T脉冲追踪脉冲标记30’’15’’7’’2’’10S(1kb)40S(Prok.850Nt/sec)新合成的都是1Kb左右的岗崎片段？两条链都是不连续合成的？？？？dUTP:dTTP=1：300／cell---A-------T--------G--------C----AUGUdutgenedUTPase少数dUTPDNA中不能有U?---A-------T----突变频率=1/1200！？---A------A------U---------UngaseungU尿嘧啶-N-糖基酶半不连续复制的证据DNA内的dump片段的存在UUdenaturedumpfragment~1200base~Okazakifragment●ung–dump片段越长,大约有一半的新生DNA为被脉冲标记的冈崎片段●dut–dump片段越短AA前导链(dUMP片段长度)后随链（冈崎片段的长度）dUMP片段脉冲追踪脉冲标记30’’15’’7’’2’’Okazaki片段在某种意义上为dUMP片段四、DNA复制的起点、方向1、复制起点（originori或o复制原点）复制开始处DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：单复制起点即－－整个染色体只有一个复制单位真核生物（Eukaryote）:多复制起点即－－一个genome中有多个复制单位Replicationfork•富含AT&发夹结构“呼吸作用”十分明显许多酶的结合位点300bp±真核生物的复制原点ATrich复制叉（Replicationfork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点2、复制方向（复制过程的顺序性）复制眼（replicationeye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛真核生物的多复制子多个复制眼（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉单向复制双向复制（2）复制的多模式单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）单起点、双方向（原核）多起点、双方向（真核）五、DNA复制的引物引物（Primer）和引发酶（Primase）DNApolymerase只能使DNA从引物的3’端延伸DNA复制如何起始？？？RNA可能提供了DNA复制的3’端1、实验证据：M13phage的DNA复制显示出对转录抑制剂的敏感性E.coli[Rifs][RifS]+M13E.coliM13+S.S.DNAvirus+RF无M13RFRifalmpinM13Rifalmpin有M13RF•Rifalmpin是E.coliRNApolymerase的抑制剂•M13RF的形成需要RNApolymerase发动合成一段RNA分子作为引物（RNA提供复制的3‘端）•RF启动后，Rifalmpin的抑制无效结论（Conclusion）：2、后续研究发现：♦细菌中先导链的合成受Rifalmpin的抑制♦后随链的合成不受Rifalmpin限制原因：♫先导链的起始需要RNApol的转录激活♫而后随链的起始由引发酶合成引物，而引发酶不受Rifalmpin的抑制六、DNA复制的转录激活(transcriptionalactivation）：DNA复制起始时通过RNApolymerse的转录过程而解开局部的双链（1）RNApol(RNApolymerase)[RifS]（2）dnaG(primase)[RifR]组装成引发体完成对后随链引物的合成主要实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个Okazaki片断总结：RNAprimedDNAreplicationRemovalofRNAprimersandfillingofgaps后随链上所包含的事件？后随链的合成及前体片段的连接引发体（包括引发酶）pppRNA引物DNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligase七、DNA复制的模式大多数以对称方式进行－－即两条链同时复制也有一定时期内DNA只复制一条链的情况1、从新起始（denovoinitiation）或复制叉式（replicationfork）比较形象的－－θ复制双链环状DNA的复制眼可以形成一种θ结构，形状像希腊字母θ，因而叫….AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.单、双向θ复制模式图单向复制双向复制2、共价延伸方式（covalenceelongation）或滚环式复制（rollingcirclereplication）由于复制时产生的滚环结构形状象σ，又称σ复制病毒、细菌因子3、置换式（Displacementform）又称D环复制线粒体和叶绿体DNA的复制方式复制叉处的复制体八、DNA复制体的结构与复制的回环模型聚合酶Ш全酶前导链后随链螺旋酶引发体引物引发酶活性中心一活性中心二PriA清除SSB提供引发体移动动力极性3‘→5’一分子的DNApolIII.协同合成前导链和后随链复制体九、线性DNA的末端复制的问题?环状DNA复制是否存在这样的问题,为什么?3‘-OH环状DNA的复制不存在这样的问题！（1）线状DNA的复制5’末端短缩的解决模式a、从开始就采取环化的形式－－－λ噬菌体b、象T7噬菌体一样采取连环分子的形式利用自身线性DNA末端的重复序列－－通过末端互补形成连环分子c、最直接的办法－－－引入蛋白质直接从末端起始复制如－－－腺病毒－2、phageΦ29、脊髓灰质炎病毒d、痘病病毒的末端由发夹结构连接复制完成后错切连接??二聚体3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OHT7噬菌体的末端复制专一性核酸内切酶腺病毒（Adnovirus-2）DNA的复制35937bpTPCGIR103-162IR;包括50bp的复制原点、富含A/T、有一个高度保守的G／C对pTP;末端蛋白的前体80kd→TP55kdSSB;单链DNA结合蛋白72kdAd2DNApolymerase;140kd复制起始复合体引发复制（不需引物）避免5’-endshortentpTp-Ser-dCMPCG●过程SSB+ATPDNA末端解链TPpTP-Ser+dCTPpTP-Ser-dCMP3‘OH腺病毒DNA复制起始G第二节DNA复制的酶学(EnzymologyofDNAReplication)一、DNA聚合反应和聚合酶1957ArthurKornberg首次发现DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ（E.coli）聚合反应：底物－－dNTPPoly(核苷酸)n－3’-OH＋dNTP→Poly(核苷酸)n+1－3’-OH＋2Pi二、三种DNA聚合酶的结构和功能其中DNApolⅢ全酶有十种共22个亚基β二聚体－－滑动钳DNApolⅠ和DNApolⅢ的主要特性和功能1、DNA聚合酶活性：两者都有条件－－模板、引物DNApolⅠ－－主要用于DNA的修复和RNA引物的替换DNApolⅢ－－DNA链的延长聚合方向：5’－3’2、3’－5’外切核酸酶活性校对功能(proofreading)3、5’－3’外切核酸酶活性DNApolⅠ的5’－3’外切活性有以下三个特点：♦必须有5’－磷酸末端♦被除去的核苷酸必须是已经配对的♦被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（切刻平移）三、DNA连接酶（DNALigase）所需条件：a、切刻的3’－OH和5’－P相邻b、切刻各自碱基处于配对状态c、需要能量原核（ATP、NAD）真核（ATP）用途：复制过程中，5’端RNA引物被置换后切刻的连接修复、重组四、与DNA几何学性质相关的酶1、解螺旋酶（helicase）:又称解旋酶单链结合蛋白（SSBsingle-strandbindingprotein2、DNA旋转酶：消除复制叉前进过程中产生的正超螺旋，产生负超螺旋第三节真核生物DNA复制的特点(DNAreplicationinEukaryote)1、复制概况a、多个复制元（multiplereplicon），双向复制b、复制元相对较小(13-900kb),复制速度较慢,大约500~5000bp/min（3000bp/min）冈崎片段100～200NTc、复制终止通过复制叉的相遇而终止multiplereplicon例；果蝇5000replicons平均40Kb（酵母）哺乳动物平均100Kb2、真核生物的DNA聚合酶α、β、δ、ε、γ五种位置核内核内核内核内线粒体合成与引发修复合成合成,修复复制功能酶结合前导链后随链3’－5’校NONOYesY