waters故障指南(中文版)

Waters故障指南1目录1色谱柱使用寿命27最理想的流速2保留时间变化28键和的碳链3保留时间漂移29pH缓冲4不同色谱柱和不同批次之间的重现性30流动相组分5样品配制问题31柱子污染6峰形拖尾原因32方法验证7正相色谱33糖类分析中的双峰8系统体积，死体积，滞后体积34方法控制9梯度方法转移35流动相pH10系统堵塞36改善信噪比11色谱柱塔板数37过载12柱压38柱子的耐用性13峰面积变化39快速分析和柱压14鬼峰40反冲柱子15pH对保留时间的影响41选择性的改变16柱平衡42新方法17柱改性43倒峰18复杂的样品44麻烦，冗长乏味，费时19疏水坍塌45快速分析20基线噪音46LC/MS的缓冲液21小孔柱47反相色谱中的碱性缓冲液22样品溶液48柱后衍生23梯度比例49梯度滞留体积24柱子保存50缓冲能力25离子对色谱51流速的变化与定量关系26反相填料的水解稳定性52极性物质的分析Waters故障指南21色谱柱使用寿命问：我的色谱柱进样大概100针后峰形变差了，踏板数很低，怎么回事？答：100针确实很少，一般情况下使用时间会长很多的。首先我们要确认你的使用条件是不是导致色谱柱寿命下降的原因。两种基本情况：1在相同实验中以前使用的色谱柱寿命长很多2在本实验中用过的所有的色谱柱在使用相同次数后全部损坏如果是第一种情况，应该检查一下实验是否保持一致。样品的组成改变了吗？样品中强吸收的污染物会破坏色谱柱的柱效。或者管路的密封圈是否完好？脱落的密封圈会堵塞色谱柱过滤器和填料的顶层，从而影响样品的分布。如果可以确认色谱条件没有变化，那么可以推测是柱床松动的原因。在实验室和运输过程中色谱柱剧烈的震动都会导致柱床松动。（色谱柱有没有掉到地上？）或者也有可能使生产商的问题。而且这种问题标准色谱柱检测中心是检测不出来的，只有在用过一段时间后才会显露出来。这种情况生产商会免费替换色谱柱。问：那些生产商真好，但是我的情况不是这样的。我的色谱柱总是用不了多长时间。有时候100针，有时候200针。200针还可以忍受，但是100针太差了。色谱柱开销太大了，我该怎么办？答：我完全同意你所说的。我们必须要找到原因然后看看我们能做些什么。最大可能是样品中的成分吸附在色谱柱的顶端。可能是在流动相中不溶的沉淀物或者是强吸收的物质。随着进样的增加这些污染物在色谱柱顶端累积，阻止样品正常吸附和扩散。从而导致峰形变差。通常这种问题和柱压升高同时出现。问：嗯，可能就是这个原因。我应该怎么避免这种问题呢？答：有几种方法可以采用。一，采用合适的样品准备技术处理样品。用和分析柱相似的固相萃取柱进行固相萃取（SPE：solidphaseextraction）1效果很好。另外一种非常有效的方法是使用保护柱。保护柱是作为牺牲柱装在色谱柱前使用的，出现问题的时候就会被替换掉。为了获得最好的分析效果，保护柱的填料和装填技术必须和分析柱一样。如果用不同品牌的填料就不能获得最佳的分析性能和保护作用。不要用大些的颗粒型号，大的颗粒或装填不好的预柱会因谱带Waters故障指南3扩展而导致分离效果变差。问：使用预柱听起来不错，还有其他方法吗？答：还有其他一些方法，但是他们都有缺陷。我不提倡用那些可能溶解色谱柱顶端污染物的溶剂去冲洗柱子。很多情况下，这个方法是没有作用的。例如，如果沉积在色谱柱顶端的污染物是蛋白质，你冲洗的时候他们已经变性很久了，甚至可能交联在一起，变得难以溶解。此外，通常色谱柱是处于水解平衡状态，而每次冲洗都会除掉水解键合相。因此，重复的冲洗柱子会加速柱子的老化。而且，冲洗后还要用流动相平衡柱子，如果是做离子对色谱的话会消耗大量的时间。另一个经常用的方法是反冲柱子。如果用和流动相不同的溶剂冲洗会产生和上面相同的问题。如果用流动相的话，需要很长的时间才能除去污染物，也有可能根本就没作用。同时，反冲柱子会削弱柱子。尽管现在的装填技术可以使柱子承受反冲，但是一般情况下不要采取这种做法。问：那么最好的建议就是使用预柱了？答：绝对是。预柱也没那么贵-一般随品牌和型号的不同价格在10$-50$之间，而他们所保护的柱子的价格是预柱的10倍左右啊。而且他们还可以避免其他来源的污染物的，这些污染物更加难以发现。这些来源包括比如流动相中的灰尘，泵脱落的密封圈的碎片，或者从流动相吸附的污染物等等。其中有些难以对付，而保护柱就可以阻挡这些。问：还有其他缩短柱子使用寿命的原因吗？答：有的，但是只要你按照生产商的说明使用柱子的话一般很少发生。有一个可能就是流动相pH超出使用范围而导致的柱子坍塌。样品用强酸或强碱溶解的话也会发生另外，一些特别的柱子有特别注意的地方例如氨基柱可以和醛，酮反应。氨基柱在不含缓冲盐的水溶液中会显强碱性，分解部分硅胶。暴露在错误溶剂中的柱子也会发生坍塌。因为这些柱子是基于非常松散的结Waters故障指南4构。他们是因颗粒之间的黏着而部分的结合在一起的。如果置于能破化这种黏着的流动相中，柱床很有可能会坍塌。氰基柱在中性溶液，苯基柱在THF中有时就会发生这种问题。这也是不要冲洗柱子的另一个理由。2保留时间变化问：我的样品峰的保留时间不一致，什么原因？答：首先我们要知道是什么样的变化，这有助于我们找到问题潜在的原因。如果在连续进样过程中出峰时间不规则的变化，那么首先查看一下泵和溶剂混合装置。可以用量筒和秒表来测定流速，从而确认泵是否在工作。在其中一种溶剂中加入示踪剂，通过观察基线确定流动相的比例是否发生变化。如果流动相的比例不变，基线就是平稳的。如果流动相的比例有变化，基线会发生相应的变化。比如你当你是使用紫外检测器的反相色谱法时，可以在有机溶剂中添加0.1%的丙酮，在254nm监测基线。另外，你也可以手动配制流动相而不用经过溶液混合装置。这样如果保留时间没有变化，那么问题就是在混合装置这里。问：连续进样过程中保留时间还是相当一致的，但是隔天进样的话就不一样了。答：这种情况的话不大可能使仪器的问题。最大可能是流动相组成的问题。在反相色谱中，保留因子k和流动相中有机相的比例是成指数关系的。通常，有机相变化1%，保留时间会变化5%-15%，一般是10%。这就是说你要非常准确的配制溶液。最好是按重量而不是按体积来配制。另外，脱气的方法也会导致保留时间变化。最好是真空超声1min。这种方法溶剂蒸发的最少，效果很好。另外还可以采用氦气脱气法。在流动相和氦气达到最初的平衡后，应该降低氦气的流速。否则氦气会带走溶液的蒸气，从而改变溶液的比例。如果你的样品时离子型或者可以电离的化合物，控制流动相的pH就变得很重要了。pH变化0.1会导致保留时间变化10%。所以要准确的测量pH，并且要校正好pH计。在反相色谱中随着pH的增加，酸性化合物保留时间缩短，而碱性化合物延长。顺便提一下，我的老师经常说：一个缓冲液之所以被称为缓冲液是应为他对pH有缓冲作用。如果没有缓冲作用，就不是一个缓冲液了。比如醋酸铵溶液就Waters故障指南5只是醋酸铵溶液，它不是缓冲液。一个醋酸盐缓冲液有醋酸离子和醋酸。如果两者在溶液中等量存在，溶液的pH就是就是该缓冲液的pK值，醋酸盐的pK值是4.75。缓冲液在pK值处有最大缓冲能力。问：我以前都不知道到控制流动相的组分和结果的重现性有这么密切的关系。还有其它需要注意的变化吗？答：另外一个重要的因素是温度。如果所有的峰的保留时间都朝同一个方向变动，可以推测是温度的影响。通常温度每变化1℃保留时间变化1%-2%。一般情况下影响没有那么大。但是有的地方在周末把取暖器或空调关掉了，发现在周末自动进样的结果和平常有差别。显然这种问题用柱温箱就可以避免。在反相色谱中检测离子型或离子化的化合物时，保留时间会因缓冲液的离子化能力不同而变化。但是这种影响微乎其微，通常都可以忽略的。标准情况下缓冲液的摩尔数改变20%保留时间会改变1%。因为配制缓冲液经常是称量的，所以不大可能犯这么大的错误。问：有没有其他一些特别的情况需要考虑一些额外的参数？答：有的。在离子对色谱中，离子对试剂的浓度会影响离子型化合物组分的保留时间。带有和离子对试剂相反电荷的分析物的保留时间会缩短，带同样电荷的会延长。中性化合物几乎不受影响。在低浓度情况下，比如5mM/L，样品和离子对试剂相互作用（竞争吸附），保留时间随离子对试剂浓度的变化呈比例变化，在高浓度情况下，比如10mM/L左右，吸附剂的表面的离子对试剂呈饱和状态，此时离子对试剂浓度的变化不会导致分析物保留时间的改变。在开发方法的时候应该考虑到这点。如果想要你的方法对某一变量不敏感的话可以这样做。正相色谱的保留时间对流动相中的极性成分非常敏感。任何情况下水都是一个麻烦。不同数量的水导致不同的保留时间。有一个窍门是使用半饱和水的非极性溶剂比如正己烷和二氯甲烷来避免这个问题。使用方法是这样，取一定体积的溶剂，加入一些水，搅拌使水呈饱和状态，混合该水饱和溶剂和等体积的不含水的溶剂。该过程可使含水的非极性溶剂得到非常好的重现性。同样也可以防止保留时间的漂移，下面将详细介绍。3保留时间漂移Waters故障指南6问：我的色谱峰保留时间发生漂移，会是什么原因呢？答：这个问题很有意思。原因有很多，让我们一个一个来看。人们通常认为保留时间漂移是平衡的问题。如果你是做正像色谱用纯硅胶柱的话就很有可能是这个问题。正像色谱的保留时间对吸附在硅胶表面的水的含量是非常敏感的，所以流动相中溶有水的话，保留时间就会漂移。因为水在正己烷或二氯甲烷等溶剂中的溶解性非常低，所以柱子要很长时间才能平衡好。我曾碰到过一个例子，用非常纯的正己烷平衡一个星期后保留时间还是漂移。所以我建议避免使用非常纯的试剂。通常使硅胶达到水平衡的做法是使用半饱和水的试剂。制备方法是一体积的水饱和的疏水试剂：一体积的纯试剂混合。这个方法可以大大缩短平衡的时间。在反相色谱中，通常很快就可以平衡的。只需要几个（5-10）柱体积的流动相就可以。当然并不是所有情况都这样。一个典型的例外就是含有离子对试剂的离子对色谱。离子对试剂的使用量一般是2-5mmol/L或更少。它们吸附在反相键和相表面，表面浓度在0.5-2μmol/m2。键和相的比表面积为330m2/g，一根4.6mm*250mm的柱子含有3g的键和相，其表面积达到1000m2。要1L的2mmol/L的离子对试剂才能平衡好柱子。当然这只是极限的情况，不过一般用几百mL平衡柱子也不少见的。不要把用过离子对试剂的柱子换成有机相保存过夜，因为换溶剂的过程中离子对试剂被洗脱下来，而再平衡又需要很长时间。问：这些现象都有一个共同点：流动相中含有低浓度的强吸收的物质。这就是导致保留时间漂移的普遍原因吗？答：是的。其他的没这么普遍。不过强吸收的物质也可能来自样品。这种情况下强吸收的物质会随着进样的增加而累积，从而导致色谱柱化学性质的改变。样品中赋形剂的吸收就是一个例子。通过观察保留时间改变的比率可以判断污染物是来自于流动相还是样品中。下面来做个实验：1重复进样几次，如：重复进4次，每次运行1小时。2不进样，泵入相同时间的流动相3重复第一步4将保留时间作图A：相对于时间B：相对于进样次数如果第一张图谱呈平滑的曲线，就是流动相中携带有污染物。如果第二张图呈平滑的曲线，样品就是污染物的来源。Waters故障指南7问：还有其他导致保留时间漂移的原因吗？答：有的。也有可能流动向组分随着时间而变化的。你如果不是使用现在带有在线混合能力的仪器的话，将会发现流动相的组分在慢慢的挥发。特别是在用氦气脱气的时候更加明显，所以应该将氦气的流速控制到最小。一个经常被低估的原因是键和相的水解。生产厂家通常规定一个pH范围，超过这个范围键和相救不稳定了。这个范围通常是2-8或9。尽管如此，还是要小心对待这些极限条件的，分界线不是非常明显的。水解通常还取决于其他条件的，比如温度和有机溶剂，在这个pH范围之类也有缓慢的水解的。键和相在中等pH条件下是最稳定的，pH3-5，低温。等度色谱条件优于梯度。当然水解确实也在等度中发生，键和相通常会自身吸附，处于一个自身平衡的状态。但是在梯度或清洗柱子的时候，使用到高浓度的有机溶