细菌鉴定

卢先雷概论学习本课件我们主要掌握和了解的内容：*什么是细菌系统鉴定？*细菌系统鉴定与细菌系统分类学*细菌系统鉴定手段（方法学）*细菌系统鉴定流程与鉴定试验的基本组合*鉴定试验的质量控制*小结与练习细菌系统鉴定的定义*以细菌系统分类学为原则，根据细菌某些生物学性状的差异，挑选一些具有较高鉴别作用的试验，经过精简与优化组合，用以测定未知细菌，得出试验结果，再与已知细菌数据库进行比较，从而推断未知细菌在分类体系中位置的方法。*细菌鉴定是细菌分类学的一种实践应用，要掌握细菌鉴定，必须掌握系统分类学。细菌系统分类学*细菌系统分类学是为研究目前已知细菌在亲缘关系上远近程度而建立起来的一整套分类方案。*使用该方案我们不仅可以了解一株未知分离菌在已知分类单元中的最佳匹配位置，还可以快速而准确的发现新种，并将之归入对应的位置。细菌系统分类学的经典书籍*BERGEY’SMANUALOFSystematicBacteriology（《伯杰氏系统细菌学手册》）是研究细菌系统分类学的全球经典书籍细菌分类单元−域−界−门−纲−目−科−属−种−型/群细菌系统分类法*传统分类法*林奈分类原理：偏重原理*数值分类法*100~200项生理生化特征相似度（百分率）：等重原理*综合分类法*生理生化、遗传物质、化学分子比较等手段综合应用细菌系统分类学手段*表型特征分类*形态学分类*生物化学代谢途径分类*噬菌体生物学分类*遗传特征分类*DNA结构分类*RNA结构分类*分子结构分类*抗原抗体血清学分类*细胞壁多糖分子与肽聚糖结构分类*细胞壁脂肪酸结构和组成分类*细胞壁蛋白电泳分类细菌之间亲缘关系表示方法*相似系数矩阵图（数值分类法）*树状拓扑学（综合分类法）*系统发育树*放射树*基础树*生物群落图（新的表示方法，尚未一致认可）相似系数矩阵图树状拓扑学细菌鉴定手段（方法学）*细菌鉴定的基本思想方法基于分类学*所采用的鉴定试验取自于分类学，根据被研究对象群体的不同，挑选和优化组合，选择出适合于临床实验室操作的鉴别能力强、可行性高的试验用于鉴定*根据试验的选择组合与这些试验操作时具体的指导思想方法、应用流程，以及借助工具的不同将细菌鉴定方法分成了几个不同阶段不同种群的细菌根据培养的难易以及实际操作时的难度而采用不同的鉴定手段*目前技术能培养的细菌采用传统手段*难培养细菌采用分子生物学手段（如麻风分支杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体等）*而传统手段难以进一步鉴定的细菌则采用抗原抗体血清学分类（如军团菌、沙门菌、志贺菌等）、细胞壁脂肪酸结构和组成分类（如棒状杆菌相关属）、挥发性代谢产物（如厌氧菌挥发性脂肪酸）指纹分析*其他：如细胞壁蛋白电泳分类、细胞壁多糖分子与肽聚糖结构分类等细菌鉴定方法学分类*传统手段——表型鉴定*分子生物学手段——基因型鉴定*抗原抗体、细胞壁成分、代谢产物指纹等手段——分子鉴定细菌表型鉴定方法学*表型鉴定方法学分类与历程：*传统林奈双岐图表法*双歧索引法*表解法*数字编码鉴定法*手工查表*仪器鉴定*酶速率法*可见光色源酶底物——梅里埃V2C*荧光色源酶底物——BDPhoenix100快速卡数字编码鉴定法原理1、形成数据库2、将试验结果转化为反应数值3、分别计算每个分类单元出现所测定反应谱型的概率4、计算鉴定符合百分率（id%）与模式频率（T值）5、根据id%、相邻id%比值、T值进行降序排序6、结果评价1、仪器只显示唯一结果，说明结果该鉴定能到到种的水平2、如果提示两个以上结果，但都是同一个属的细菌。则说明该鉴定只能达到属的水平3、如果鉴定id%＜80%，则结果不可靠4、如果仪器提示结果不可接受，则说明1）试条/卡选择错误2）分离菌不适合采用该方法3）菌不纯，特别是显示出大于两项生化反应结果不符合时。酶速率法*梅里埃VITEK2compact*可见光色源酶底物如对硝基苯胺（金黄色）作为呈色基团*BDPhoenix100快速卡*荧光色源酶底物如荧光香豆素、4-甲基-7-羟基-香豆素衍生物，可见光色源如对硝基苯胺（金黄色）作为呈色基团原理：底物-色源复合物(无色)游离色源待检酶水解底物酶速率法原理V=Δy/Δx=tanαODtcutoffV＞cutoff=“+”V＜cutoff=“-”αMALDI-TOF基质辅助激光解吸电离飞行时间*原理：检测来自完整细菌的蛋白质构成。先将待测样本与基质混合，均匀涂布在样品板上，放入MS仪器。基质吸收来自激光的能量，与样本一起蒸发，与此同时将样本电离。带电样本通过电场进入飞行时间检测器，离子依质荷比不同而分离，最终可以在飞行管的末端检测到每个离子的丰度。通过查阅比对内置指纹图谱数据库即可得出鉴定结果MALDI-TOF指纹图谱细菌鉴定试验、流程与鉴定试验的基本组合*鉴定试验*试验流程*试验的选择与组合鉴定试验*形态学观察*生化反应试验*血清学试验*分型试验*血清学分型*噬菌体分型（不常用）*细菌素分型（不常用）*动物试验（普通临床实验室不用）形态学观察镜下形态学观察：•不染色标本–暗视野动力观察–念珠菌孢子和菌丝的观察–丝状真菌小培养动态观察–L型菌落与特殊细菌菌落解剖结构•染色后镜下形态–Gram染色–抗酸染色–异染颗粒染色–荧光染料染色–荧光抗体染色–乳酸酚棉兰染色–墨汁染色形态学观察菌落形态观察：*大小（细如针尖、小、中等、大）*质地（坚硬、干燥、湿润、水滴状）*光滑程度（粗糙、光滑、粘液型）*凹凸（扁平、微凸、凸起、中性凹陷）*颜色（白色、灰色、黄色、绿色、红色、黑色等）*透明程度（透明、半透明、不透明）*边缘（整齐、星状、有伪足、枫叶状、树叶状等）*溶血性（α、β、γ）*其他、琼脂凹陷、气生菌丝、菌落背面颜色、菌落特殊气味等形态学观察*营养需求（血琼脂、巧克力、营养琼脂生长情况）*胆盐耐受（麦康凯生长情况）*万古霉素耐受（含万古霉素巧克力生长情况）*液体培养基生长现象（菌膜、上半部生长、均匀浑浊、下半部生长、沉淀）*半固体动力现象（清晰、毛刷样、倒伞状）生化反应*OF试验*各种糖发酵试验、糖氧化试验*糖衍生物发酵（α/β-甲基葡萄糖、β-葡萄糖胺、β-葡萄糖醛酸等）*淀粉、糖原水解*七叶苷水解*甲基红与VP试验*甘油复红*2-酮基葡萄糖酸盐还原试验*蛋白质代谢试验*明胶水解*石蕊牛乳液化（酪蛋白水解）*凝固血清液化（肽酶）*氨基酸水解试验*脱羧酶（精、鸟、赖）*脱氨酶（苯丙氨酸、色氨酸）*精氨酸双水解*尿素水解*吲哚产生*H2S产生*碳源、氮源利用试验*常用的有枸橼酸盐、醋酸盐、丙二酸盐、苹果酸盐（观察方法有同化和分解两种）*其他包括各种糖类、有机酸盐、各种氨基酸和胺类（只观察同化现象）*马尿酸水解试验*硝酸盐还原、产气试验*胆汁溶菌试验*拉丝试验*多糖合成试验酶类试验*氧化酶*酚氧化酶*改良氧化酶*触酶*耐热触酶*Superoxol试验*凝固酶*DNA酶*玉米脂酶*吐温水解*卵磷脂酶*磷酸酶*链激酶*芳氨酶（肽酶）*吐温水解*糖苷酶（如OPNG）底物所检测的酶丙氨酰－苯丙氨酰－脯氨酰-对硝基苯胺丙氨酸－苯丙氨酸－脯氨酸芳胺酶吡咯烷基-对硝基苯胺吡咯烷基芳胺酶γ-谷氨酰-对硝基苯胺谷氨酰芳胺酶β-丙氨酰-对硝基苯胺β-丙氨酸芳胺酶L-脯氨酰-对硝基苯胺L-脯氨酸芳胺酶酪氨酰-对硝基苯胺酪氨酸芳胺酶氨基乙酰-对硝基苯胺氨基乙酸芳胺酶谷氨酰-甘氨酰-精氨酰-对硝基苯胺谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶L-天冬氨酰-对硝基苯胺L-天冬氨酸芳胺酶亮氨酰-对硝基苯胺亮氨酸芳胺酶焦谷氨酰-对硝基苯胺焦谷氨酸芳胺酶L-赖氨酰-对硝基苯胺L-赖氨酸芳胺酶精氨酰-对硝基苯胺精氨酸芳基酰胺酶苯丙氨酰-对硝基苯胺苯丙氨酸芳胺酶各种芳氨酶及其检测底物特殊诊断纸片鉴定法*Optochin敏感试验*杆菌肽敏感试验*复方新诺明敏感试验*O129敏感试验*新生霉素敏感试验*溶菌酶敏感试验生长以及生长抑制试验*KCN抑制试验*0%NaCl生长试验*6.5%NaCl耐受试验*亚碲酸钾还原试验*4℃生长试验*42℃生长试验*55℃生长试验血清学试验（常用）*链球菌Lancefield抗原分型乳胶试剂*肺炎链球菌乳胶试剂*MRSA乳胶试剂*嗜肺军团菌分型血清*沙门菌血清*志贺菌血清*EPEC、EIEC、ETEC、O157:H7血清*霍乱弧菌分型血清血清学试验（不常用）*铜绿假单胞菌生物分型血清*脑膜炎奈瑟菌分型血清*隐球菌可溶血抗原血清*脑膜炎5种可溶性抗原复合乳胶*b型流感嗜血杆菌乳胶*肺炎链球菌乳胶（含83个血清型的多价血清）*A群脑膜炎奈瑟菌乳胶*B群脑膜炎奈瑟菌/大肠埃希菌K1乳胶*C群脑膜炎奈瑟菌乳胶血清学试验（不常用）*B群链球菌乳胶*布鲁菌抗体检测乳胶*小肠结肠炎耶尔森菌分型血清*白喉抗毒素检测*肺炎链球菌荚膜肿胀试验*肥大外菲试验试验流程*第一步：形态学试验*第二步：快速定向试验*第三步：系统生化鉴定*第四步：血清学分型试验*第五步：特定细菌的抗生素天然敏感、天然耐药反证法鉴定形态学试验G+菌BA生长、Choc不生长、MecK不生长，——Gram染色：分G+co（革兰阳性球菌）,G+b（革兰阳性杆菌）G+co—依靠溶血特征，菌落形态、菌落颜色、菌体形态区分:▲葡萄球菌：淡黄色/白色，中等大小，较凸，规则圆形，β/γ溶血，较湿润，除金黄色葡萄球菌外，一般不具有临床意义；▲微球菌：黄色/白色/橙色，中等大小，较凸，规则圆形，不溶血，较干燥，不易乳化较葡萄球菌生长缓慢，该菌一般无临床意义；▲链球菌：白色/灰白色、凸起小菌落，β溶血为溶血型链球菌，其中化脓性链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌菌落相对较大（多在1.0mm左右），而咽峡炎链球菌，马链球菌等菌落则较小（多在0.5mm左右）；灰白隆起中心扁平或凹陷，1.0-1.5mm大小的宽大а溶血为肺炎链球菌；细如针尖，白色凸起а溶血的为草绿色链球菌；▲气球菌：白色凸起小菌落，а溶血，1.0mm左右，有特殊气味（酷似乙醛），菌落较草链大。镜下为短链或葡萄球菌样排列，菌体大而着色不均▲肠球菌：灰白，低凸，2.0mm左右之а溶血菌落，较湿润；▲口腔球菌：白色凸起较大菌落，不溶血，黏着，接种针挑之则整个菌落挑起，琼脂上不留痕迹。▲孪生球菌：白色小菌落，β/γ溶血，菌落黏着不易刮取，但在盐水中易乳化，较湿润，在质量较好的新鲜血琼脂或哥伦比亚血琼脂上易生长，在含血MHA上不生长。G+b—依靠溶血特征，菌落形态、菌落大小、菌体形态区分：▲棒状杆菌：白色1.0-1.5mm左右大小，较干燥，不溶血/狭窄β溶血的为白喉或一般棒状杆菌；小而湿润，灰白/无色，半透明的为J-K棒状杆菌；灰白细小，β溶血的可能为化脓放线菌、溶血分泌杆菌；▲芽孢杆菌：灰白大菌落，表面粗糙如毛玻璃状、蜡状、边缘不规则，不同种类菌落形态差异巨大，宽大β溶血。延长培养时间，菌落从湿润变得干燥，边缘呈放射状扩散，形成叶状、掌状、雪花状、齿轮状等；BA生长、Choc生长、MecK不生长，——Gram染色：分G+co及G+b▲G+co：平面球菌、藻球菌：血琼脂上为а溶血，0.5-1.0mm大小，在Choc上呈现金属色泽。▲G+b：乳杆菌：细小，白色凸起а溶血菌落，有特殊的酸臭味；BA生长、Choc生长、MecK生长，——Gram染色：G-b—氧化酶、麦康凯琼脂颜色▲肠杆菌：氧化酶（-），麦康凯琼脂上红色色/粉红色/无色湿润大菌落；▲弧菌：氧化酶（+），麦康凯琼脂上红色/无色不透明扁平大菌落；▲非发酵菌：氧化酶（+/-），麦康凯琼脂上无色透明小菌落—鲍曼不动杆菌为中等大小，菌落聚集处橙红色，单个菌落为橙色BA缓慢生长、Choc缓慢生长、MecK不生长，——Gram染色：分G-b及G-cob：▲HACEK族：嗜沫/副嗜沫嗜血杆菌（巧克力上生长良好）、艾肯氏菌、碳酸噬胞菌、放线杆菌、金氏菌（G-cob）；▲心杆菌：人类心杆菌；▲鞘氨醇单胞菌：少动鞘氨醇单胞菌；▲莫拉菌（G-cob）：缺陷莫拉菌、非液化莫拉菌、奥斯陆莫拉菌；▲寡源菌；▲黄杆菌及相关种：包括鞘氨醇杆菌、产吲哚金色杆菌、黏液威克菌、动物伤口伯杰氏菌、短稳杆菌等；▲甲基杆菌：嗜中温甲基杆菌；▲巴斯德菌；