《生物技术大实验》实验手册(试行)0906

1《生物技术大实验》实验指导（试行）四川农业大学农学院2目录第一章基因克隆技术………………………………………………………3实验一植物基因组DNA的提取及检测………………………………………………3实验二RNA的制备和分析………………………………………………………………6实验三蛋白质的提取及检测……………………………………………………………9实验四琼脂糖电泳技术…………………………………………………………………11实验五PCR基因扩增及其影响因素分析………………………………………………17实验六核酸印迹技术-DIG标记探针的分子杂交……………………………………20实验七λDNAHindⅢ酶切鉴定…………………………………………………………24实验八DNA片段的纯化回收…………………………………………………………26实验九DNA体外重组…………………………………………………………………29实验十重组DNA的蓝白筛选…………………………………………………………31第二章植物基因转化技术………………………………………………35实验一农杆菌浸染的油菜花瓣转化表达GUS基因试验……………………………35实验二基因枪介导的基因转化实验……………………………………………………38实验三转化目的基因的检测-GUS组织化学染色……………………………………39第三章植物育种分子标记技术………………………………………40实验一RAPD分子标记技术……………………………………………………………36实验二SSR分子标记技术（包括垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳）………………………43实验三SNP分子标记技术………………………………………………………………47第四章重组蛋白诱导表达………………………………………………49实验一大肠杆菌菌种的活化和菌种的保存……………………………………………49实验二感受态细胞的制备-采用CaC12法制备感受态细胞…………………………50实验三碱式裂解法提取表达载体质粒…………………………………………………52实验四大肠杆菌的热激转化法…………………………………………………………54实验五Taq聚合酶基因的诱导表达……………………………………………………55实验六Taq聚合酶的提取纯化…………………………………………………………57实验七SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Taq聚合酶分子量及纯度………………58实验八Taq聚合酶活性单位标定和比活性检测………………………………………60第五章生物信息数据库及生物软件的使用…………………61实验一NCBI等数据库的使用…………………………………………………………61实验二常用生物软件的使用……………………………………………………………633第一章基因克隆技术实验一植物基因组DNA的提取及检测实验目的通过本实验学习和掌握从植物组织中提取DNA的方法实验原理基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。实验材料玉米、马铃薯等农作物叶片试剂配方1.CTAB抽提缓冲液Table1CTABExtractionBuffer(100ml)*1MTris-HclpH8.0NaCl0.5MEDTA-8.0CTABBME7.5ml6.2g3.0ml2.0g0.2ml*Usefreshlymade.Warmbufferto60-65℃beforeaddingCTAB(cetyltriethylammoniumbromide)andBME(β-mercaptoethanol).AddBMEjustpriortouseunderafumehood.2.氯仿/异戊醇（24:1,v/v）:将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。实验步骤41.Sampleleaves(orotherorgans)fromvaseorfield.Itispreferabletouseyoungleavesafterdarknesstreatmentofseveraldays,althougholderleavesthatarenotsenescentmaybeused.2.Placesamplesinavacuumbottlewithicetokeepthemcool(butdonotallowtofreeze).Samplesmaybestoredat-80℃untilreadytocontinuethefollowingsteps.NOTE:Oncesamplefrozen,donotallowittothawuntilcontinuingstep4.3.Removemidrib,cutleavesinto1cmsections,putinamortarpre-frozen,addliquidnitrogen,grindtoafinepowderwithapre-frozenpestleandladleina5mlcentrifugetubeuptoaboutthe2mlmark.4.Add2mlwarm(65℃)CTABextractionbuffer(table1)andmixseveraltimesbygentleinversion.5.Incubateina65℃waterbathfor30-40min,mixinggentlybyinversionevery10min.NOTE:Wearrubberorplasticglovesandgoonwithstep6-9underafumehood.6.Addonevolumeofchloroform/isoamylalcohol(24:1)andmixgentlybyinversionfor15min.7.Spininatable-topcentrifugewith8000~10000rpmatroomtemperaturefor15min.Pipetteofftopaqueouslayerintoanew5mltube.NOTE:Below15℃theCTABandnucleicacidcomplexmayprecipitate,ruinpreparationandevencausedamagetothecentrifuge.8.Repeatstep6and7inordertoeliminateproteinclearly.9.Pipetteofftopaqueouslayerintoanew5mltubeandaddonevolumeofisopropanol,mixwellandkeepat-20℃foratleast10mintoseparateouttheDNA.10.UseapintohookouttheDNA.Rinseitwithice-cold70%ethanoltwiceandabsoluteethanolonce.11.Drypelletinvacuumdesiccatorwithmiddlespeedfor10min.12.DissolvetheDNAin50μlHPLCH2O.(Add3μlof10mg/mlRNaseA(pre-boiled),mixbygentleinversionandincubateat37℃for30min.)13.Dilute50-500timesandreadabsorbanceat260nmand280nminspectrophotomemterandcalculateconcentrationandquality.14.Storeat4℃foruseor-20℃foralongtime.注意事项51.叶片磨得越细越好2.移液器的使用3.由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。6实验二RNA的制备和分析实验目的通过本实验学习和掌握从植物组织中提取RNA的方法实验原理RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。材料玉米、水稻、小麦等农作物根或叶仪器试剂(一)仪器1．低温离心机2．分光光度计3．琼脂糖胶电泳系统，用前先用1%NaOH溶液浸泡过夜，之后再用DEPC水浸泡冲洗。4．高压灭菌锅5．研钵、剪刀、一次性手套等(二)药品1.焦碳酸二乙酯(DEPC)2.吗啉代丙烷磺酸(MOPS)3.异硫氰酸胍4.醋酸钠(NaAc)5.氯仿6.苯酚7.甲醛8.乙醇9.乙二胺四乙酸(EDTA)10.琼脂糖711.异丙醇(三)试剂配方1．0.1%DEPC水0.1mlDEPC加入100ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。2.2mol/LNaAc、0.5mol/LEDTA、4mol/L异硫氰酸胍、4mol/LLiCl等均用DEPC水配制。3.5ΧMOPS电泳缓冲液(pH7.0)MOPS0.1mol/LNaAc40mmol/LEDTA5mmol/L(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤方法11.取幼叶约250mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5ml离心管；2.加入1mlTRIZOL提取液震荡摇匀；3.室温放置5min后，加入0.5ml的氯仿，剧烈摇动离心管5min；4.在8℃条件下，12000rpm离心15min；5.溶液分为两层，下层为酚－氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管，加入0.5ml异丙醇在15~30℃条件下，沉淀10min；6.然后在,2~8℃条件下，12000rpm离心10min，RNA沉淀管壁和底部；7.去掉液体部分，加入1ml75%酒精洗2次；8.风干后，加入25µlDEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-80℃冰箱备用。方法21.匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1mlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有how(event)class=t_tagDNA污染。c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml8TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。5.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。6.2-8℃10000×g离