清华大学博士论坛会议论文集9

维管植物大麦（H.vulgareL.）腐解组分对铜绿微囊藻光合系统的影响肖溪1，陈英旭*，傅钲浩，张敏（浙江大学环境与资源学院环境保护研究所，杭州310029）摘要：使用大麦腐解液代替水配制培养基培养铜绿微囊藻，对比研究了不同前处理方式对于腐解组分抑制铜绿微囊藻效果的影响。研究结果表明，不同前处理方式得到的腐解组分理化性质不同，其抑藻能力相差较大（抑制率变化范围为19.5%-58.6%），充分曝气并预灭菌是较好的前处理方式。腐解产生的化感组分对藻细胞光合系统有显著影响，表现如下：作为光反应中心的叶绿素a含量下降（8.0g（干重）/L时5d、10d抑制率分别为47.0%、58.6%）；作为天线辅助系统的藻胆蛋白含量下降，且组分发生改变（10d时别藻蓝蛋白相对含量从17.8%下降到10.7%，藻红蛋白相对含量从51.7%增高到60.0%），并因此影响藻细胞的光反应效率，作用位点主要在别藻蓝蛋白和藻红蛋白上。关键词：大麦；化感作用；光合系统；前处理方式ResponseofthePhotosyntheticSystemofMicrocystisaeruginosatoVascularPlantBarleyDecompositionProductsXIAOXi,CHENYing-xu*，FUZheng-hao，ZHANGMin(InstitutionofEnvironmentalScienceandTechnology,CollegeofEnvironmentalandResourceSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China)Abstract:Microcystisaeruginosawasco-cultivatedwithbarleydecompositionsusingdifferentpre-treatmethodsandtheeffectofinhibitionwasstudied.Resultsindicatedthattheinhibitionrateofdecompositionswithdifferentpre-treatmentsvariedobviously(inhibitionrate:19.5%-58.6%);autoclavedandaeratedwouldbethebestwaytopre-treat.Allelochemicalsinbarleydecompositionssignificantlychangedthephotosynthesissystemofalgae.ChlorophyllAcontentdecreasedaswellasthecontentsofphycobiliproteinduringthetreatment(at8.0g(dryweight)/Linhibitionrateof5dand10darerespectively47.0%,58.6%).Inaddition,thecompositionsofphycobiliproteinsasantennaproteinchangedsignificantly(anphycocyanin’srelativecontentdecreasedfrom17.8%to10.7%,whilephycoerythrim’srelativecontentincreasedfrom51.7%to60.0%).Thustheefficiencyofphotoreactionwaschangedwiththemaintargetsonanphycocyaninandphycoerythrim.Keywords:barley;allelopathy;photosynthesissystem;pre-treatment由富营养化导致的藻类暴发，尤其是蓝藻暴发，已成为一个世界性的问题。有毒藻类暴发严重威胁人类生命安全，其产生的藻毒素可以通过食物链的生物放大效应，使人致病或死亡[1-2]。其中最受关注的淡水水华优势种，铜绿微囊藻（Microcystisaeruginosa），是一种光能自养原核生物，具有一套独特的生理学机制和进化机制，具有极强的生态学竞争优势，是我国蓝藻藻华优势种。它产生的微囊藻毒素有强致肝癌性，危害很大。寻求生态安全性好的控制铜绿微囊藻生长方法是水环境研究中亟待解决的关键问题之一。20世纪80年代起，大量的现场和实验室研究发现，大麦秆在水体中的降解可以有效抑制包括蓝藻、绿藻、硅藻等多种藻类的生长，进而控制富营养化的发展，并有效改善水生生态系统的结构和功能[3-4]。1990年以来，利用大麦秸秆防治藻类暴发的方法在欧美各国成功应用，但仍有部分研究认为大麦腐解组分不具有抑制藻类生长的能力；在报道成功抑制藻类的工作中，有效控藻所需的大麦腐解液浓度差别也较大，从0.025到10g(干重)/L不等[3-4,7-8]。这些研究中所采用的大麦秸秆腐解前处理方式各异，是否前处理方式的不同引起试验结果的差异，目前还缺乏相关的研究。本文就维管植物大麦腐解组分对铜绿微囊藻光合系统的抑制作用开展研究，测定了腐解组分对铜绿微囊藻叶绿素a及藻胆蛋白的影响，比较了不同前处理方式制备的腐解液抑制效果的变化，以期阐明植物腐解组分抑藻的机理，为实际工程应用提供科学依据。1材料与方法1.1大麦腐解组分对藻类生长的急性抑制试验收稿日期：2009-07-31；修订日期：2009-09-09基金项目：国家科技重大专项课题（2008ZX07101-006）作者简介：肖溪（1986~），女，博士研究生，研究方向为富营养化与藻类控制，E-mail：[e-mail]通讯联系人：E-mail：[e-mail]铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa,FACHB469)购自中科院武汉水生生物研究所，采用BG11（pH=7.1）培养基培养，温度为25±0.2℃，光强为2000lux，光暗比为12h：12h，每天早晚轻摇2次。大麦秸秆剪成2cm的碎段，按表2所示前处理条件分成6组，处理30d后腐解液过0.22μm滤膜避光保存待用。取对数生长期的铜绿微囊藻，细胞接种初始浓度为1×106cell·ml-1，按比例用大麦腐解液代替培养基中水，每个浓度3个平行。在5d，10d取样，显微计数。表1BG11培养基配方Tab.1BG11MediumforCyanobacteria药品名称工作液浓度（g/L）药品名称工作液浓度（g/L）NaNO31.5柠檬酸铁铵0.006K2HPO4•3H2O0.04EDTA(二钠盐)0.001MgSO4•7H2O0.075Na2CO30.02CaCl2•2H2O0.036A5+Co溶液*1ml柠檬酸0.006蒸馏水919ml*A5+Co溶液配方（加入1000ml蒸馏水中）药品名称加入量（g）药品名称加入量（g）药品名称加入量（g）H3BO32.86gCuSO4•5H2O0.079gZnSO4•7H2O0.222gMnCl2•H2O1.81gNa2MoO4•2H2O0.390gCo(NO3)2•6H2O0.049g1.2生理指标的测定[5]在5d，10d取样，用95%乙醇低温暗处提取后分光光度法测定叶绿素a含量。取藻液20mL，11963×g离心5min(25℃)，弃上清液后，加入3.0mLPBS(0.05mol·L-1，pH6.8)，放入超低温冰柜中(-86℃)冷冻8h，然后暗处解冻，如此反复冻融3次，5862×g离心10min(4℃)，上清液用酶标仪测定620nm、650nm、565nm下的光吸收值，按下式计算藻胆蛋白各组分含量：藻蓝蛋白(PC，mg·L-1)=(OD620nm－0.7×OD650nm)/7.38；别藻蓝蛋白(APC，mg·L-1)=(OD650nm－0.19×OD620nm)/5.65；藻红蛋白(PE，mg·L-1)=[OD565nm－2.8(PC)－1.34(APC)]/1.27。2结果与讨论2.1不同前处理方式对大麦腐解组分性质的影响本试验采用灭菌/不灭菌、曝气/厌氧、光照/避光等6对不同组合的前处理方式，收集腐解30天制备的液体，发现其理化性质存在较大的差异（表2）。6个处理组得到的腐解液pH变化范围从酸性到碱性（5.05-8.21）；溶解氧含量变化范围从0.00，0.25到5.92。说明不同前处理条件下，大麦腐解的过程是不同的，其中1#到4#为好氧发酵，而5#，6#为厌氧发酵。同为好氧发酵的4个处理组中，由于前处理方式不同导致发酵菌群不同，进而使得到的腐解液理化性质表现出差别，其中的化学成分浓度与组成也不尽相同（来源于本课题组未公开发表数据）。表2不同前处理方式制备大麦腐解液的理化性质Tab.2Charactersofbarleydecompositionsusingdifferentpre-treatmethods处理组别前处理方式处理时间(d)pHDO(mg/L)T(℃)1#高压灭菌，曝气，光照307.314.4429.02#高压灭菌，曝气，避光307.064.4828.93#不灭菌，曝气，光照308.215.9228.94#不灭菌，曝气，避光308.063.7629.25#高压灭菌，厌氧发酵，光照306.660.2529.16#高压灭菌，厌氧发酵，避光305.050.0028.72.2不同前处理方式对铜绿微囊藻生长抑制的影响利用前述大麦腐解液，进行了不同前处理方式对大麦腐解组分抑藻效应的影响研究。分别测试了加入大麦腐解液5天、10天后藻的生长情况，结果如图1所示。从图1可以看出，腐解组分10天时抑藻效果较5天更好，表明大麦腐解液中化感物质的抑制作用非急性毒性作用，与赖氨酸、邻苯三酚、咖啡酸等化感物质作用机理不同[5-6]。总体来看，腐解组分对铜绿微囊藻的作用呈现出“低促高抑”效果，浓度达到8g(干重)/L时能有效抑制藻类生长，藻细胞密度为对照的41.4%至80.5%。1#，2#与3#，4#比较发现，高温灭菌去除大麦秸秆原位附生微生物后，腐解组分对藻类抑制作用增强，因此腐解液的抑藻能力主要是化感物质的作用，而非与大麦秸秆伴生的细菌。Redge和Everall等研究也发现，大麦秸秆浸泡液对藻类抑制主要是化学机理，而非生物机理[7-8]。1#，2#与5#，6#比较发现，曝气处理比厌氧发酵得到的腐解液抑藻能力更强；从pH来看，抑藻能力由强到弱依次是中性碱性酸性。试验结果表明，在大麦秆控制蓝藻的实际应用中，充分曝气并高温灭菌是较好的前处理方式。图1不同前处理方式下大麦腐解液对铜绿微囊藻的生长抑制率Fig1InhibitionrateofgrowthofMicrocystisaeruginosaexposuredonbarleydecompositionsusingdifferentpre-treatmethods.Allerrorbarscorrespondtothestandarddeviation2.3不同前处理方式对铜绿微囊藻叶绿素a抑制率的影响叶绿素a是蓝藻光合系统的光反应中心，加入不同前处理方式得到的大麦腐解液5天及10天后，铜绿微囊藻藻细胞叶绿素a含量抑制率的情况如图2所示。从图2可以看出，腐解组分对藻细胞叶绿素a含量呈现抑制作用，且10天时抑制率显著高于5天。蓝藻是原核生物，细胞内无叶绿体，但有非垛叠类囊体，类囊体表面结合藻胆体。由藻蓝蛋白（PC，phycocyanin）、别藻蓝蛋白（APC，anphycocyanin）和藻红蛋白（PE，phycoerythrim）三种色素与辅基蛋白形成藻胆体结构，执行收集和传递太阳光能的作用，而由叶绿素a与辅基蛋白形成光反应中心进行光合作用的原初光化学反应[9]。李峰民等研究也发现，化感物质胁迫促进了藻细胞叶绿素的降解[10]。图2不同前处理方式下大麦腐解液对铜绿微囊藻叶绿素a含量的抑制率Fig2InhibitionrateofchlaofMicrocystisaeruginosae