泛素-蛋白酶体通路-生命科学研究进展

泛素介导的蛋白质降解——2004年诺贝尔化学奖主讲人：石武良博士2011.11.22蛋白质合成蛋白质是生命活动的直接执行者，生命过程中几乎所有的环节都与蛋白质有关。对于蛋白质的合成取得了辉煌的成就（5项诺贝尔奖），但对于蛋白质降解这一领域的研究长期被忽略。•胞质合成途径（游离核糖体）•内质网合成途径（结合态核糖体）RoadmapofproteinsortingFunctionsofcytoplasmicmatrix:Theproteinsynthesis,degradationandmodification.Cellscarefullymonitortheamountofmisfoldedproteins.Anaccumulationofmisfoldedproteinsinthecytosoltriggersaheat-shockresponse,whichstimulatesthetranscriptionofgenesencodingcytosolicchaperonesthathelptorefoldtheproteins.2004年2004年10月16日瑞典皇家科学院将该年度诺贝尔化学奖授予以色列科学家阿龙·切哈诺沃、阿夫拉姆·赫什科和美国科学家欧文·罗斯，以表彰他们在泛素调节的蛋白质降解研究领域中的卓越成就。蛋白质降解调控动植物体内几乎所有的生命活动（细胞增殖、分化、凋亡、DNA复制和修复、转录和蛋白质质量控制等，参与病原体的入侵、致病和免疫等过程）：•蛋白质在行使其功能后，需要在特定的时空条件下被降解；•蛋白质在合成、折叠、转运、或行使功能过程中发生错误或损伤时，需要被及时降解和清除；•食物中的蛋白质，也要经过蛋白质降解酶的作用降解为多肽或氨基酸才能被人体吸收。蛋白质的降解途径（2种）•溶酶体：不需能量主要降解细胞外和细胞膜蛋白质•泛素-蛋白酶体通路：需能高效、特异的蛋白质降解过程，控制着动植物体内绝大多数蛋白质的降解泛素-蛋白酶体通路概述蛋白质的降解是一个精细控制的过程，首先有待降解的蛋白质被一种多肽（称之为泛素）所标记，接着这些蛋白质进入细胞的蛋白酶复合体中，蛋白酶复合体是一个上下有盖的圆桶状酵素，它们如同细胞的回收站，专门负责蛋白质的分解及再循环利用，泛素在这一过程中释出讯号，让蛋白酶复合体分辨出有待降解的蛋白质。意义了解了泛素为媒介的蛋白质裂解作用和过程，使得科学家对细胞如何控制及分裂蛋白质的研究有可能深入到分子层级。而当蛋白质裂解作用发生异常时，人体就会产生不适甚至疾病，如子宫颈癌症和囊肿纤维症等，因此，从分子层面角度去了解泛素调节的蛋白质降解的化学过程和机理，及对生命过程进一步的探索，具有十分重要的应用意义。应用实例•2003.5美国食品医药管理局批准应用一种新型的蛋白酶体抑制剂Velcade（PS-341，万珂），治疗骨髓瘤；•2004.4，欧洲药品评价机构也允许Velcade在欧盟上市（46个国家）；•雷公藤-雷公藤素也是一种蛋白酶体抑制剂，它能通过控制癌细胞的蛋白酶体活性进而诱发癌细胞凋亡。•应用前景广阔泛素—蛋白酶体途径(upp)的组成泛素—蛋白酶体途径(upp)由泛素(ubiquitin,ub)以及一系列相关的酶组成。除泛素以外还包括4种酶家族:泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzyme,E1)、泛素偶连酶(ubiquitin-conjugatingenzymes,E2s)也称泛素载体蛋白(ubiquitin-carrierprotein)、泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-ligatingenzymes,E3s)和蛋白酶体(proteasome)。蛋白的泛素化和去泛素化都需要多种酶介导,upp既有高度底物多样性又具有针对不同调控机制的多样性。泛素的结构与组成泛素含有76个氨基酸残基,广泛存在于真核生物,目前尚未发现泛素存在于原核生物中，泛素的氨基酸序列极其保守。泛素基因主要编码两种泛素前体蛋白质:一种是多聚泛素,另一种是泛素融合蛋白。泛素—蛋白酶体途径(upp)一系列相关的酶•泛素活化酶(ubqiuitin-activatingenzyme,简称E1)是催化泛素与底物结合所需的第一个酶。•分子量110-130kDa，由1100个左右氨基酸残基组成，对靶蛋白的识别几乎没有特异性。•拟南芥E1由单基因编码的大小分别为110kDa和117kDa的两个亚基组成。•E1活性很高，低浓度即可激活泛素。E1（泛素激活酶）泛素偶连酶(E2)是泛素与蛋白底物结合所需的第二个酶。拟南芥基因组中至少存在37个E2基因，分为12个亚族。E2有一个由150个氨基酸残基（分子量14-16kDa）组成的保守区域,含有半胱氨酸残基，接受从E1-泛素复合物转移过来的活化的泛素分子，形成E2-泛素复合物；在E3的协同作用下，E2-Ub复合物把活化的泛素分子转移到底物蛋白上，形成单泛素化蛋白或者多聚泛素化蛋白。E2（泛素结合酶）E3是泛素蛋白酶体途径中种类最多的一种酶，是在底物的特异性选择降解过程中作用最为关键成员。它的主要功能是识别应该被泛素化的靶蛋白，然后使活化的泛素接近特异靶蛋白的Lys，从而将泛素转移到底物上去。E3分子量较大，约100-300kDa。E3（泛素连接酶）植物中已鉴定的E3有5类•HECT型E3•RINGfinger/U-box型E3•APC复合体•SCF复合体•CUL3-BTB复合体蛋白酶体是催化泛素与底物蛋白偶联体降解的关键酶,包括20s蛋白酶体和26s蛋白酶体。26s是由20s和19s复合体共同结合装配而成,此组装过程需要耗能。20s蛋白酶体是主要起催化作用的复合体,它由14个不同的蛋白组装成一个筒状结构,由内层2个β环和外层2个α环组成,每个环含有7个亚基,基本结构可书写成α7β7β7α7。α亚基主要用于底物识别,β亚基主要参与底物降解。19s复合体由17或18个亚基组成,在特定条件下又可分成2个次级复合物,一个叫盖子(lid),一个叫底座(base)。底座由10个亚基组成,其中6个有ATP酶活性,它们与底物泛素化有关,盖子由8个没有ATP酶活性的亚基组成,其中一个亚基Rpn11/Pda/s13在泛素循环方面起重要作用。26S蛋白酶体26S蛋白酶体的结构细胞内的废弃物处理装置——蛋白酶体一个细胞大约含30000个细胞废弃物处理装置即蛋白酶复合体——蛋白酶体，这些桶状结构可以几乎将所有蛋白质分解为7-9个氨基酸长度的缩氨酸，蛋白酶体的活性表面在桶状结构的内部。蛋白酶体能辨别出与泛素结合的蛋白质，一旦作为标签的泛素脱离蛋白质，即可利用三磷酸腺苷提供的能量改变蛋白质的性质使其从一端进入蛋白酶复合体内发生降解，并最终以缩氨酸的形式从另一端释放出来。这一过程如此复杂，需要消耗能量。然而蛋白酶体并不能选择待降解的蛋白质，细胞内主要是通过E3类酶的特异性选择并利用泛素加以标签，从而选择正确的待降解蛋白质。黑点表示活性区域，蛋白质降解的场所泛素化和去泛素化泛素通过E1和E2被激活的过程称为泛素的活化。泛素的活化过程是一个依赖ATP的酶促反应：①首先泛素活化酶(ubiquitinactivatingenzymeE1)催化泛素C末端的甘氨酸(Gly)形成Ub－腺苷酸中间产物,然后激活的泛素C末端被转移至E1酶内Cys残基的－SH键上,形成高能硫酯键;②含有高能硫酯键的泛素通过转酰基作用使其进一步转移到泛素载体蛋白(ubiquitinconjugatingenzyme,E2)特异的Cys残基上,形成E2－Ub巯基酯;E2－Ub巯基酯提供泛素分子,使泛素C端甘氨酸与底物蛋白的Lys残基的氨基形成共价键,由第一个泛素单体与底物蛋白内部的Lys残基的ε氨基(或β氨基)结合;③泛素可以直接从E2转移给底物蛋白形成Ub蛋白复合物,这时的底物多是些碱性蛋白(如组蛋白),而在大多数情况下,底物蛋白先与泛素连接酶(ubiquitinligatingenzyme,E3)特异性结合,E3可使E2和底物蛋白相互接近,继而蛋白底物与E2酶连接的泛素结合,这样就完成了底物蛋白质的泛素化。1和3：E1、E2催化的泛素激活反应，消耗ATP；2：E3催化的蛋白质激活反应，消耗ATP；4：依赖于E3的蛋白质泛素化反应；5：不依赖于E3的蛋白质泛素化反应；6：26S蛋白体催化蛋白质水解；7和8：异肽酶催化的水解反应，使泛素游离出来。去泛素化作用是泛素化过程的逆转。在真核细胞内已发现多种去泛素化酶,它们能够水解泛素和底物蛋白之间的硫酯键,还能把错误识别的底物从泛素化复合体中释放出来。它们又可以分为两类:（1）泛素羧端水解酶(ubiquitinC-terminalhydrolases(UCHs))：分子量为20～30KD,水解去除和泛素C末端连接的小肽,也参与泛素多聚体产生泛素单体的过程,促进泛素再循环,对泛素系统的正常运行是很有必要的。（2）泛素特异性加工酶(ubiquitin-spicificprote2ases-UBPs/USPs)：分子量大约为100KD,参与去除和解聚底物蛋白质上的多聚泛素键,从而防止多聚泛素在底物蛋白的聚集。泛素—蛋白酶体途径(upp)介导的蛋白水解过程由泛素介导的蛋白水解过程,分为2个阶段。第一阶段:多个泛素分子与靶蛋白共价结合。首先,泛素经泛素活化酶E1活化,泛素上76位的Gly与泛素活化酶上特殊的Cys残基形成一个高能硫酯键,并伴有ATP水解;然后,通过转酯作用,泛素从泛素活化酶转移到泛素结合酶E2的Cys上,形成泛素结合酶-泛素;最后,在泛素连接酶E3参与下,泛素又从泛素结合酶转移到受体蛋白(靶蛋白)的Lys残基上,形成泛素-靶蛋白,使靶蛋白发生泛素化。多个遍泛素分子重复地附加到靶蛋白上,则形成分枝的多Ub链。泛素共有7个Lys残基,在多聚泛素链结构中,其中一个泛素的C-末端Gly与相邻的泛素之间通过Lys48、Lys63或Lys29连接。第二阶段:靶蛋白在26s蛋白酶体的作用下,由泛素介导的蛋白水解过程。经泛素活化的底物蛋白被展平后,通过两个狭孔,进入26s蛋白酶体的催化中心,蛋白降解在20s蛋白酶体内部发生。进入26s蛋白酶体的底物蛋白质被多次切割,最后形成3～22个氨基酸残基的小肽。整个流程分为以下六个步骤：1、E1类酶激活泛素，该过程需要ATP（三磷酸腺苷）提供一定能量；2、泛素转移至E2类酶；3、E3类酶具有特异性，可以识别出需破坏的目标蛋白质，与目标蛋白质接近的E2-泛素复合体将泛素转移至目标蛋白质；4、E3类酶释放出被泛素标记的蛋白质；5、被标记的蛋白质分子尾端形成一小段泛素分子链；6、泛素分子链在蛋白酶体的端口被识别并脱离蛋白质，目标蛋白质进入蛋白酶复合体的桶状通道最终降解为缩氨酸并由另一端口释放出去。UPP参与的生物学功能1、抗原提呈：抗原分子泛素化后被26s蛋白酶体降解成多肽,然后由组织相容性复合体(MHC)I类分子提呈到细胞表面,再被细胞毒性T细胞(CTL)识别。2、调节细胞周期：UPP调节降解调节蛋白,如细胞周期因子、信号传导蛋白等,在控制细胞周期尤其是生殖细胞方面起重要作用。细胞周期因子先被泛素化,然后由26s蛋白酶体降解,导致周期因子依赖的激酶失活,从而使细胞有丝分裂期中止。细胞周期因子-周期因子依赖的激酶复合体可由它们特定的抑制因子使其失活,这些抑制因子也由泛素-蛋白酶体途径降解。G1checkpoint:fissionyeastcells:Startpoint；Animalcells:RestrictionPointM期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化UPP与疾病UPP与许多人类疾病有关。与泛素相关的疾病可分为2种:一种是泛素体系酶的突变导致的功能丧失或者是目标底物蛋白识别基序的改变,而导致某种蛋白的稳定。另一种是目标蛋白功能不正常或加速降解的结果。泛素蛋白酶体途径是细胞内环境稳定的关键调节因素,细胞的许多重要蛋白都在此通路的调控之下。泛素蛋白酶体通路对细胞内信号转导及细胞生长调控是一个很重要的调节因素,并与许多生理及病理过程密切相关。肿瘤发病机制