第九章 基因克隆载体

第九章基因克隆载体通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域1、克隆位点(一个或多个)2、能携带外源DNA片段进入受体细胞:能自我复制，或整入染色体随受体细胞DNA复制而复制3、有选择克隆子的标记基因4、安全性(不含损害受体的基因，不任意转入别的，尤其人的细胞)按克隆载体的来源分：质粒噬菌体质粒-噬菌体DNA杂合载体人工染色体分类2质粒克隆载体质粒适于载体构建的性质１、组成与构型是染色体外裸露的双链DNA分子（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）l-DNAoc-DNA基本步骤：细菌生长和质粒的扩增菌体收获和溶菌质粒纯化质粒的分离纯化方法细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒质粒复制强度：紧密控制型(Stringentcontrol)松驰控制型(Relaxedcontrol)紧密控制型只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子松驰控制型后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒。经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）。3、质粒的可转移性两个细菌接触，供体菌通过性菌毛将DNA直接转入受体菌内，使受体菌获得新的遗传性状的过程亲和性质粒：能在同一细胞中稳定共存的几种质粒不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中稳定共存的质粒意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒。４、质粒的不相容性1、灭活质粒转移基因，杜绝污染事件，保证安全2、分子尽可能小（转化率高），转化率↓3、克隆位点4、选择标记基因——抗性基因，报告基因5、组装各种“元件”，如启动子、终止子等6、构建过程力求简单二、质粒克隆载体构建的基本策略pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建p：质粒（plasmid)BR：两位主要构建者322：实验编号与pBR322区别：乳糖操纵子的一个DNA片段（lacZ`基因）替换Tcr基因；组装了一个多克隆位点（MCS）连杆pUC19质粒载体α-互补含乳糖操纵子的启动子、调节因子和β-半乳糖苷酶的N端146残基(α-肽)合成有活性的基因（lacZ`）的质粒载体引入可编β-半乳糖苷酶码C端部分残基的宿主(与LacZ`互补的大肠杆菌)实验中使用IPTG以诱导β-半乳糖苷酶操纵子。X-gal在β-半乳糖苷酶作用下生成深蓝色产物。实验中使用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)而非直接使用β-半乳糖X-gal以及β-半乳糖均为β-半乳糖苷酶底物，但是X-gal不能诱导β-半乳糖苷酶操纵子。蓝白筛选酵母质粒载体酿酒酵母中的2um环状质粒病毒基本结构：DNA（或RNA）+外壳蛋白感染细菌的病毒，称为噬菌体。分类（根据病毒与宿主的关系）：温和性病毒：溶原性增殖→构建病毒载体烈性病毒：溶菌性增殖→改造后噬菌体载体一、λ噬菌体克隆载体λ噬菌体性质λDNA+外壳蛋白1、λDNA(48.5kb)噬菌体中：线性宿主细胞：环状(cos位点)λ噬菌体基因组有基因30个以上转导transduction概念：以噬菌体为媒介，将供体菌DNA片段转移到受体菌内，使受体菌获得新的遗传性状。3、限制性核酸内切酶位点:56种（p477）4、λ噬菌体的生长途径溶菌生长途径溶原生长途径λ噬菌体载体的构建λ噬菌体本身存在着种种缺陷，必须对它进行多方面的改造，才能满足理想载体的要求缩短野生型入DNA的长度，提高外源DNA片段的有效装载量删除重复的酶切位点，引入载体多克隆位点，增加外源DNA片段克隆的可操作性灭活某些与裂解周期有关的基因，使λ噬菌体载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，避免可能出现的生物污染现象的发生引人合适的选择标记基噬菌体-质粒杂合载体由质粒和含cos位点的λDNA片段组装成的载体，即cosmid人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统，包括YAC、BAC、PAC。染色体基本功能单位包括复制起始点(replicationorigin)、着丝粒(centromere)和端粒(telomere)。复制起始点，保证了染色体复制，着丝粒保证了染色体分离，端粒封闭了染色体末端，防止粘附到其他断裂端，保证了染色体的稳定存在第五节人工染色体克隆载体酵母人工染色体是由复制起点、端粒和着丝粒构成的线状DNA最大优点是能容纳大分子外源DNA，平均在420kb左右，最大达1．0×10kb。作为一种有效的载体工具，YACs已经广泛用于各种生物基因组分析6酵母人工染色体载体系统YACs可容纳调控元件构建基因文库基因治疗基因功能鉴定人工染色体克隆载体的应用YAC克隆载体的优缺点YAC载体可以容纳更长的容易形成嵌合体在YAC载体中容易出现缺失和基因重排难于分离和纯化