常用分子生物学技术概述-2009

TheDepartmentofBiochemistryandMolecularBiology生物化学与分子生物学教研室分子生物学理论及进展Theoryandprogressofmolecularbiology一．常用分子生物学技术二．基因组与蛋白质组三．基因工程四．基因诊断五．基因治疗六．生物信息学七．考试课程设置（21学时）常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication石嵘[e-mail]操作对象：核酸蛋白质DNARNA制备分析操作以核酸为主要对象来讲述主要内容一、常用分子生物学技术：•质粒DNA的提取•基因组DNA/RNA的提取•核酸的纯化、分离及定量•聚合酶链式反应（PCR）•DNA序列分析•核酸杂交技术二、其他分子生物学技术：主要技术质粒DNA提取DNA/RNA的提取纯化、分离及定量聚合酶链式反应（PCR）DNA合成酶切片段限制性酶切技术探针标记分子杂交技术DNA序列分析生物信息学提取DNA总的原则1保证核酸一级结构的完整性；（pH4～10；0～4℃;机械剪力；核酸酶等）2尽量排除其他分子的污染,保证提取核酸的纯度;1)其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；2)核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；3)其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。核酸分子抽提的技术路线的设计1、核酸的释放：破裂细胞释放核酸机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应用最广泛的方法）2、核酸的分离与纯化：•将含有核酸分子从复杂复合物或他物质分离中分离3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤•沉淀可去除部分杂质与某些盐离子•加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）•少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤鉴定与保存（一）核酸的鉴定浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定1、荧光光度法2、紫外分光光度法DNAOD260/280=1.8RNAOD260/280=2.0浓度与纯度鉴定1紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。如计算DNA浓度：A260×稀释倍数×50＝μg/ml只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。浓度：DNA双链:1OD~50µgDNA单链或RNA:1OD~40µg寡核苷算单链:1OD~33µg纯度：A260/280之比应在1.80NanoDropND-1000spectrophotometer.2.荧光光度法NanoDrop®ND-3300Fluorospectrometer3EB荧光分析法荧光染料溴化乙锭(EB)，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于半定量分析。完整性鉴定凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。凝胶电泳法：BIO－RADGelDoc2000凝胶成像系统ImageQuantRTECL凝胶成像系统核酸的贮存——DNA保存1、短期贮存：4℃或-20℃存放于1×TE（tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2、长期贮存：TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。核酸的贮存——RNA保存•RnaseInhibitorRNA酶抑制剂HumanPlacentalribonucleaseinhibitor（HPRI）是一种蛋白质，可与多种RNA酶（包括RNasesA,B,C类）非共价结合成为等摩尔复合物，抑制RNA酶活性。•RNA可溶于DEPC水（焦碳酸二乙酯）中，在-70℃保存。•RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-20℃保存。质粒DNA的提取PlasmidDNAPreparation分子生物学技术•质粒的基本概念•质粒提取的原理和方法•质粒的纯化质粒DNA的提取•质粒：质粒是染色体以外能自身独立复制的超螺旋共价闭环双链DNA分子。•能自主复制，是能独立复制的复制子。•质粒能携带外源基因进入细菌中扩增或表达.是基因工程中广泛应用的基因运载工具.•常见质粒载体pUC：pUC119，pUC118，pUC18,pUC19，T—载体pBR：322，327质粒结构图启始复制子多克隆位点抗性基因标记基因•质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术．1、细菌的培养•主要步骤：2、细菌的收集与裂解3、分离纯化质粒DNA的提取和纯化质粒DNA的小量制备2-5ml质粒DNA的大量制备500ml碱裂解法方法煮沸法SDS裂解法Triton-溶菌酶法质粒提取的主要方法质粒DNA提取方法的选择•常用的碱裂解法,煮沸法，SDS法均可获得较满意效果．至于有人采用碱裂解法提取小量细菌培养物的质粒，用煮沸法或SDS法进行质粒DNA的大量分离，只是各个实验室的习惯问题.质粒提取的主要方法•碱裂解法：原理：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的.细菌在强碱性环境中裂解，蛋白质变性，染色体DNA被蛋白质包裹缠绕，质粒DNA被释放出来。特点：操作简单、成本低、产量高、纯度好.质粒提取的主要方法•煮沸裂解法原理：加热可使蛋白质和染色体DNA变性，但环状质粒DNA结构紧密而不会解链，温度下降后，质粒DNA又重新恢复超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，回收上清液中质粒DNA。特点：煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。对于会释放出大量糖类的菌株(HB101)不适宜.质粒提取的主要方法•SDS裂解法特点：提取大质粒（大于15kb）的首选方法，产量要低得多原理：将细菌悬浮在等渗的蔗糖溶液中，以溶菌酶和EDTA裂解,再酚-氯仿抽提DNA。质粒DNA的纯化•1、Sepharose4B或SephacelS-1000柱层析法•2、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）法•3、聚乙二醇沉淀法•4、氯化铯—溴乙锭梯度平衡超速离心法PPrO纯化的目的：去除非质粒DNA的污染物；还区分不同分子构型基因组DNA/RNA的提取GenomicDNA/RNAPreparation分子生物学技术DNA提取1、蛋白酶K－酚－氯仿法（酚抽提）2、甲酰胺解聚法3、试剂盒总的技术路线粗分离前处理精分离酚抽提法原理:经消化或剪切匀浆成单个细胞的真核细胞,在蛋白酶K,SDS,RNA酶作用下,消化破裂细胞膜与核膜,Pr变性并降解成小肽或aa.DNA从核蛋白中游离,与pr分开,同时RNA酶降解污染的RNA.利用饱和酚、氯仿抽提使Pr与DNA分离，在高盐存在下用乙醇沉淀收集DNA.应用：DNA大小100-200Kb,可用于DNA酶切图谱,多态性分析,基因诊断和构建基因组文库.DNAEXTRACTIONVIRTUALLAB的提取DNA检测：1、电泳检测2、紫外分光度计检测OD260/280=1.8Sizing,quantificationandqualitycontrolofDNA3、Agilent2100bioanalyzerRNA的提取1、异硫氰酸胍法2、Trizol3、NP40－蛋白酶K法4、盐酸胍法方法的选择：根据组织的情况以及各方法的优点进行选择。一定要注意防RNA酶的污染RNA提取的主要方法•一步法特点：简便、快捷，RNA的完整性和纯度高原理：以（异）硫氰酸胍和-巯基乙醇为裂解液裂解细胞，PH在4.0的条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤改进：以（异）硫氰酸胍-酚为裂解液，再加入氯仿形成两相，变性的DNA与蛋白质位于两相之间，上层是RNA溶液。最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤RNA质量检测：1、电泳（28S：18S＝2：1）2、紫外分光度计检测OD260/280＝2.0＞1.83、Agilent2100bioanalyzerIndustrystandardofRNAqualitycontrolmRNA的分离原理：以总RNA为起始材料，利用核酸的碱基配对原理，通过寡聚（dT）纤维素或者寡聚（U）琼脂糖亲合层析从大量的RNA中分离mRNA。方法：（1）oligo(dT)-纤维素层析柱法（2）oligo(dT)-纤维素液相结合离心法（3）磁珠分离法oligo(dT)-纤维素层析柱法磁珠分离法核酸的分离纯化方法•电泳技术是分离，鉴定和纯化DNA片段的首选标准方法•分类：•琼脂糖凝胶电泳•聚丙烯酰胺凝胶电泳•脉冲场凝胶电泳非变性PAGE变性PAGE倒转电场凝胶电泳错位均匀电场电泳核酸的分离纯化方法•琼脂糖凝胶电泳:分离0.5~25kb的DNA片段•非变性PAGE：小的双链DNA，分辨率高达1bp•变性PAGE：单链DNA片段，分辨1bp以上•倒转电场凝胶电泳：分离10~2000kb的DNA分子•错位均匀电场电泳:可分离几百万碱基对的DNA分子DNA片段的回收主要方法：（1）低熔点琼脂糖挖块法（2）玻璃棉离心法（3）透析袋脱洗（4）冻融法（5）胶的压碎浸泡法聚合酶链反应PolymeraseChainReaction分子生物学技术1985年，Mullis创建了聚合酶链反应技术，简称PCR技术。(1993年诺贝尔奖）这是一种在体外由引物介导的DNA序列酶促合成反应，可以增加靶基因的拷贝数达百万倍，极大的提高了检测灵敏度。PCR技术简介•PCR起源•PCR技术的七种基本成份•PCR技术引物设计的原则•PCR的基本反应步骤•PCR的主要用途•几种重要的PCR衍生技术一、PCR技术的起源•PCR方法始于20世纪70年代初，由Khorana(1968)与他的同事提出，作为一种降低化学合成基因工作量的策略•1985年，KaryMullis及其同事报道用大肠杆菌DNA聚合酶I片段体外扩增单拷贝基因•1988年，耐热稳定DNA聚合酶的应用使PCR技术得以广泛应用PCR技术对靶基因扩增的工作原理二、PCR体系基本组成成分模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+•一价阳离子K+•维持PH值的缓冲液热稳定DNA聚合酶•来源：•嗜热和高度嗜热的真细菌，其聚合酶类似于常用的DNA聚合酶Ⅰ•可供选择的种类很多，主要合成大片段DNA产物需要的保真度、效率及合成能力而决定•常规PCR，TaqDNA聚合酶最为常用。嗜热水生菌(Thermusaquaticus)反应体系里的其它几种成分•二价阳离子Mg2+：DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，通常是Mg2+•维持pH值的缓冲液：•调至8.3～8.8之间，72℃温育后，pH值下降至7.2左右•一价阳离子：Kcl对于扩增大于500bp的DNA片段是有益的。提高KCl的浓度对于短片段的DNA扩增有利•模板DNA：•线性DNA模板扩增效率较高，•高分子量DNA为模板时，先用内切酶消化，效果更佳•质粒DNA10ng，基因组100ng左右三、PCR技术引物设计•如何来设计引物？•如何来扩增我们的目的基因？首先尝试在起始密码子前，终止密码子后设计引物，以获得含完整编码序列的基因或cDNA.但许多基因编码序列的两端不具保守性，或两端虽具有保守序列但不适宜设计为PCR引物。可从基因内部来寻找保守序列，并设计引物。通过PCR扩增出基因的部分序列，再以次序列作为探针筛选基因组文库或cDNA文库，或利用PCR技术获得完整基因和全长cDNA.PCR技术引物设计的原则1.引物与模板的序列要特异性的互补2.长度：一般为20-27bp3.G+C含量：一般为40%-60%4.引物不能在模板的非目的引发DNA聚合反应，即错配3’3’5’5’5’5’引导DNA合成的寡核苷酸引物5’ACTGCGTGCACGTGGGGTCCCAGGG3’hairpindimerCrossdimer设计原则例：His-Phe-P