肝糖原测定

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。3.掌握吸量管和微量移液器的使用方法。4.掌握各种溶液混匀及转移的方法。5.正确掌握使用离心机和分光光度计的方法步骤。二、实验原理1.肝糖原的提取糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。2.糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。CuSO4+2NaOH=Na2SO4+Cu(OH)2↓2Cu(OH)2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O2CuOH=Cu2O↓(红色)+H2OCu(OH)2⍙CuO↓(黑色)+H2O3.肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10—100mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。三、实验材料1.样品鸡肝2.试剂95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/LNaCl溶液、浓HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）蒽酮显色剂3.仪器和器材1、普通离心机，室温至100℃恒温水浴箱，722型分光光度计，天平2、剪刀、镊子、研钵3、试管架，离心管，试管4、刻度吸量管（2ml,5ml），1000μl微量可调取液器5、100ml容量瓶6、白瓷反应板四、实验方法（一）实验流程1.肝糖原提取、鉴定实验流程：鸡肝约1.50g，剪碎＋5%CCl3COOH1ml研磨至乳状＋5%CCl3COOH3ml研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心3分钟（4000r/min）沉淀（弃去）上清液（取2ml）＋2ml95%乙醇，混匀，静置10分钟离心5分钟（4000r/min）上清（弃去）沉淀＋蒸馏水1ml沸水浴2分钟，溶解沉淀白瓷板孔穴中糖原溶液1ml＋浓HCl250μl加碘试剂2滴加碘试剂2滴沸水浴15分钟，冷却糖原溶液2滴＋50%NaOH250μl呈色对比糖原水解液2滴糖原水解液＋班氏试剂4滴混匀沸水浴2分钟，观察变化2.肝糖原定量实验流程：鸡肝0.15g＋30%KOH1.5ml（用吸量管）沸水浴15分钟冷却，全部转入100ml容量瓶中加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液糖原的测定（二）操作步骤1.肝糖原提取、鉴定（见表1）步骤操作（1）肝匀浆准备称取肝组织约1g，放入盛有1ml5%三氯醋酸的研钵中，将肝组织磨至乳状后，再加入5%三氯醋酸3ml，在磨成肝匀浆，4000r/min离心3min，上清液倾入另一干净离心管中。（2）提取糖原向上清液中加入等量的95%乙醇，混匀，静置10min，离心5min（4000r/min）。倾去上清液，白色沉淀为糖原。加入蒸馏水1ml，并加热使沉淀溶解，溶液呈乳样光泽。（3）糖原鉴定1与碘反应：取碘试剂2滴于白瓷板孔穴中，加糖原溶液1滴，观察其呈色。另一孔穴只加碘试剂2滴，作呈色对比。2糖原水解液汇总葡萄糖的鉴定：取糖原溶液1ml于小试管汇总，加浓盐酸5滴，置沸水浴中水解15min，取出冷却。用50%NaOH中和（约5滴）。另取一小试管加班氏试剂4滴，加上述糖原水解液2滴混匀，在沸水浴中（或直接在酒精灯上）加热2min，观察并记录所见表1肝糖原的提取与鉴定实验步骤2.肝糖原定量测定（见表2）步骤操作(1)糖原提取在试管中加入30%KOH1.5ml，在称取0.15g肝组织放入试管中，置沸水浴中15min。取出后冷却，将管内容物全部移入100ml容量瓶，定容，摇匀。(2)糖原的测定取3支试管，按下表操作：试剂（ml）空白管标准管样品管蒸馏水1.0--标准葡萄糖溶液-1.0-糖原提取液--1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5混匀，沸水浴10min，冷却。洗净比色杯并用滤纸擦干，在3个比色皿中分别加入空白管溶液、标准管溶液、样品管溶液。在分光光度计620nm波长处，先用空白管溶液调零，再依次测定标准管溶液与样品管溶液的分光度（A），测3次取平均值表2肝糖原定量测定实验步骤（三）注意事项1.肝糖原提取、鉴定（1）肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的95％乙醇后，务必注意混匀。由于最终混合液比较多，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。（2）糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下，吸附碘后呈现红棕色。（3）糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。（4）离心时，一定要注意对称，质量配平，若听到离心机声音过大，应立即停止离心。（5）吸取1ml量溶液时使用可调微量移液器，吸取1ml以上量溶液时使用刻度吸量管。2.肝糖原定量测定（1）肝组织必须定量，精确，因为要涉及到后期的计算。（2）肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则影响比色。（3）注意定量转移，取量务必准确。（4）蒽酮试剂必须2倍于被测液。且蒽酮含有浓硫酸，转移需用刻度吸量管。（5）若肝糖原含量小于1%，须改用间接测量法，即肝组织消化后，用95%乙醇沉淀糖原，用蒸馏水2ml溶解糖原，再用蒽酮试剂显色、比色。五、实验现象与结果分析（一）实验现象1.肝糖原提取、鉴定鸡肝上清液经乙醇处理并混匀、静置后可看到明显白色沉淀物（表明上清液中肝糖原含量高）。见下图：图1鸡肝上清液经乙醇处理后混匀静置糖原溶液滴加碘液后，对比碘液和蒸馏水，有明显变化，有砖红色物质生成，说明有糖原生成。见下图：图2呈色对比糖原水解液加班氏试剂沸水浴后有棕红色沉淀析出。见下图：图3糖原水解液加班氏试剂沸水浴后2.肝糖原定量测定肝组织和KOH溶液沸水浴后，溶液呈浅红色，无沉淀，证明肝组织全部溶解。见下图：碘试剂+蒸馏水碘试剂+糖原溶液图4鸡肝与KOH溶液沸水浴后将鸡肝溶解液全部移入容量瓶，加蒸馏水至刻度线混匀后，溶液呈浅米黄色。水浴后空白管（左）呈浅黄色，标准管（中）呈孔雀绿色，样品管（右）呈浅灰绿色（颜色介于空白管和标准管之间）。见下图：图5加蒽酮试剂水浴后颜色配置空白管、标准管、样品管时，溶液均有放热现象，表明蒽酮遇水、标准葡萄糖溶液和糖原提取液时均能产热。（二）实验结果与分析1.实验中所取肝组织为0.15g。2.3支试管在620nm波长处的吸光度（取平均值）测定次数各管吸光值A620空白管标准管样品管100.5940.363200.5940.362300.5940.363各管平均值A—62000.5940.363表3620nm波长吸光值记录表3.结果分析：按下式结算肝组织中的肝糖原的含量：肝糖原（g/100g肝组织）=标准测定AA×0.05×）肝组织重（g100×1000100×1.11≈2.261g由公式计算得本组肝糖原含量为2.261g/100g肝组织。结果：该样品中肝糖原含量为每100g肝组织含肝糖原2.261g讨论：正常情况下，饱食鸡肝肝糖原含量为2-3g/100g肝组织，本组实验中肝糖原含量为2.261g/100g肝组织，所以实验所取鸡肝处于饱食状态，实验结果在正常范围内，证明实验成功。